本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及的一种甲基化DNA高通量测序接头和引物设计方法。其特征在于针对切位点是否含酶，不同非连接端突出结构类型以及不同连接端类型，设计不同的接头和引物，解决MeDIP与亚硫酸盐翻转导致序列改变之间的矛盾，能够在不影响MeDIP的情况下，经亚硫酸盐之后成功扩增DNA片段库并能进行后续的常规建库。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】一种甲基化DNA高通量测序接头和引物设计方法
本专利技术涉及的
是基因组学、生物
，特别涉及的是一种甲基化DNA高通量测序接头和引物设计方法。具体而言包括:一种甲基化DNA高通量测序接头和引物设计方法，其特征在于对于是否含酶切位点，非连接端突出结构类型和连接端类型，设计不同的接头和引物，解决MeDIP与亚硫酸盐翻转导致序列改变之间的矛盾，能够在不影响MeDIP的情况下，经亚硫酸盐之后成功扩增DNA片段库并能进行后续的常规建库。
技术介绍
在高等真核生物基因组中，DNA甲基化是在不改变DNA碱基种类与数量的前提下使得被修饰DNA的空间结构发生改变导致基因的沉默或过度表达，从而使生物体表型呈现出多样化。在癌细胞中，这些启动子发生去甲基化，从而使得这些基因能够表达。另外，甲基化水平的降低促使了某些基因的表达，会促进从良性扩增到恶性扩增的转变。DNA甲基化对基因表达模式以及基因组稳定性均起着至关重要的作用。鉴于DNA甲基化在人类疾病发生、发展过程中的重要作用，并且DNA甲基化修饰作用于全基因组水平，因此其检测技术的发展左右着对甲基化的研究与认识，进而在很大程度上影响着研究者们对于人类疾病特别是癌症相关疾病的研究。目前，现有的基于测序仪的DNA甲基化检测技术主要有直接亚硫酸氢盐测序、MeDIP测序、MBD测序、酶切-亚硫酸氢盐测序等几种方法。亚硫酸盐直接测序法的主要问题在于海量数据分析问题。尤其是对于高等哺乳动物这种庞大基因组的测序数据分析，测序后对海量数据的拼接和重新比对，工作量巨大，工作步骤复杂。其次是测序成本问题。无法适应大多数分子生物学实验室作为常用实验技术的要求。MeDIP测序和MBD测序法的主要问题在于该技术没有在测序前进行亚硫酸氢盐的磺酸化处理，必需对甲基化位点进行鉴定，大大增加了后续的工作量。酶切-亚硫酸氢盐测序的问题主要是酶切识别位点的固定性会导致片段大小的分布差异很大。因此，该方法使部分有生物学意义和功能的DNA甲基化不能被检测到。同时上述方法均都存在一个共同的问题，会致使大量无生物学功能的测序数据的产生。其原因在于在现有的建库和测序方法中，基因组由大量重复序列组成的异染色质区域数据占据测序数据的很大比例，这是因为在待测基因中含有高甲基化CpG的重复序列区。因此，去除掉重复序列后只对功能区DNA的甲基化片段进行测序可大大节省测序成本。无论上述哪种方法，辅助接头均是在DNA甲基化检测技术中的重要一环。辅助接头是指:加入辅助接头的目的是在DNA在进行MeDIP和亚硫酸盐磺酸化后能经过PCR反应后使单链DNA变成双链，从而能进行常规文库制备辅助接头的类型:根据DNA片段化的方法不同以及碱基修饰的不同的分类。目前，甲基化的亚硫酸盐测序利用的甲基化的接头。由于该接头的所有胞嘧啶位点都是甲基化的，DNA片段在连接甲基化的测序接头后经亚硫酸盐翻转之后，接头的序列不发生改变，PCR之后仍和测序引物匹配。但是甲基化接头影响了MeDIP实验中甲基化抗体绑定甲基化片段，因此该接头不适用于MeDIP后亚硫酸盐甲基化测序。而如果在MeDIP前连接没有甲基化的接头，亚硫酸盐翻转会致使接头序列发生改变而和测序引物不匹配。如果在亚硫酸盐前不加接头，双链DNA经MeDIP和亚硫酸盐之后变成单链DNA,并且序列发生改变,常规建库所用的PairedEndadapter与PairedEndprimer无法在本实验方法中使用。因此本专利技术引入辅助接头解决MeDIP与亚硫酸盐翻转导致序列改变之间的矛盾，能够在不影响MeDIP的情况下，经亚硫酸盐之后成功扩增DNA片段库并能进行后续的常规建库。同时在亚硫酸盐PCR之后要把辅助接头剪切去掉，以减少测序成本。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种甲基化DNA高通量测序接头和引物设计方法，从而解决目前辅助接头存在的MeDIP与亚硫酸盐翻转导致序列改变之间的矛盾，同时在亚硫酸盐PCR之后要把辅助接头剪切去掉，以减少测序成本； 本专利技术是采取以下技术方案实现: 一种甲基化DNA高通量测序接头和引物设计方法，其特征在于，辅助接头为下述a-h中的至少一种: a为不含酶切位点，非连接端为一条链突出结构，连接端为粘末端； b为含酶切位点，非连接端为一条链突出结构，连接端为粘末端； c为不含酶切位点，非连接端为树杈结构，连接端为粘末端； d为含酶切位点，非连接端为树权结构，连接端为粘末端； e为不含酶切位点，非连接端为一条链突出结构，连接端为平末端； f为含酶切位点，非连接端为一条链突出结构，连接端为平末端； g为不含酶切位点，非连接端为树杈结构，连接端为平末端； h为含酶切位点，非连接端为树杈结构，连接端为平末端； 辅助接头，引物选自下述(ι)-(νι)中的至少一种: (I)当辅助接头为a和c时，引物设计成互补于经过亚硫酸氢盐翻转处理的辅助接头的序列，且在5’末端额外连接有限制性内切酶的识别位点，所述的限制性内切酶的识别位点位于引物上，并保证该酶的切割位点位于辅助接头与待测DNA连接点的上下游5bp的范围内；与待测DNA片段连接方式为粘性末端连接； (II)当辅助接头为b和d时，辅在辅助接头中靠近辅助接头与待测DNA连接点的上游5bp内位置设计酶切位点，该酶切位点需符合以下三个特点:1)该酶切位点至少包含一个甲基化胞嘧啶；2)酶切位点内不含有非甲基化的胞嘧啶；3)该酶切位点不含有CpG 二核苷酸位点；与待测DNA片段连接方式为粘性末端连接； (III)当辅助接头为e和g时，引物设计成互补于经过亚硫酸氢盐翻转处理的辅助接头的序列，且在5’末端额外连接有限制性内切酶的识别位点，所述的限制性内切酶的识别位点位于引物上，并保证该酶的切割位点位于辅助接头与待测DNA连接点的上下游5bp的范围内；与待测DNA片段连接方式为“T-A”连接。当进行酶切时，采用针对所设计的限制性内切酶的酶切位点的酶进行单酶切； (IV)当辅助接头为f和h时，在辅助接头中靠近辅助接头与待测DNA连接点的上游5bp内位置设计酶切位点，该酶切位点需符合以下三个特点:1)该酶切位点至少包含一个甲基化胞嘧啶；2)酶切位点内不含有非甲当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甲基化DNA高通量测序接头和引物设计方法，其特征在于，辅助接头为下述a‑h中的至少一种：a为不含酶切位点，非连接端为一条链突出结构，连接端为粘末端；b为含酶切位点，非连接端为一条链突出结构，连接端为粘末端；c为不含酶切位点，非连接端为树杈结构，连接端为粘末端；d为含酶切位点，非连接端为树杈结构，连接端为粘末端；e为不含酶切位点，非连接端为一条链突出结构，连接端为平末端；f为含酶切位点，非连接端为一条链突出结构，连接端为平末端；g为不含酶切位点，非连接端为树杈结构，连接端为平末端；h为含酶切位点，非连接端为树杈结构，连接端为平末端；
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：严冰冰，孔祥生，邹晓文，吴海芳，
申请(专利权)人：晶能生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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