本发明专利技术公开了一种引物对，其中，该引物对包括：如SEQ ID No：1所示的上游引物和如SEQ ID No：2所示的下游引物。本发明专利技术还公开了一种检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒，其中，该试剂盒包括：如上所述的引物对和阻拦序列；所述阻拦序列为在对经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA进行PCR扩增的退火过程中，优先于如上所述的引物对特异性结合到未甲基化的SEPT9DNA上，并阻止如上所述的引物对与未甲基化的SEPT9DNA结合的核苷酸序列；所述SEPT9DNA为经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA。本发明专利技术另外公开了一种如上所述的引物对在制备用于检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种引物对及检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒，以及所述引物对在制备用于检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒中的应用。
技术介绍
结直肠癌是较为常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势。据统计，世界范围内2007年新增结直肠癌病例数为120万，当年因结直肠癌死亡人数达60万，在西方国家其发病率居恶性肿瘤谱的第二位。随着生活水平的不断提高和饮食习惯的改变，我国结直肠癌的发病率也日渐增高，在我国大城市的结直肠癌致死率排在第四，乡村结直肠癌致死率排在第五。结直肠癌的发生是多种遗传和后天变化转化正常的粘膜为癌前病变腺瘤，以致最终的结直肠癌。及时发现和去掉前期腺瘤可以显著地降低结直肠癌病人的死亡率。结直肠癌早期诊断并手术的病人五年生存率可以达到90%以上。但是晚期结直肠癌病人五年生存率低于10%。因此，提高结直肠癌诊断特别是早期诊断是非常重要的。早期结直肠癌常常没有症状。这表明需要对适龄的没有症状的人群进行结直肠癌普查。目前，普遍使用的结直肠癌检查方法主要有两种：一是结直肠镜检查，这是检测结直肠癌的金标准，但该方法有侵入性，昂贵，不易操作，并大部适龄人群难以接受，很难用于大规模普查。二是粪便隐匿血检测和粪便免疫组化检测，主要通过检测粪便里的血迹来作为结直肠癌早期诊断的依据，该方法虽然是非侵入性的，廉价的，但是缺乏灵敏性和特异性。在过去的几十年，随着基因组学、遗传学和分子生物学技术的飞速发展，研究发现：对比正常组织，在结直肠癌肿瘤中基因p16、ALX4、SEP9、TMEFF2、BMMP3、EYA2和Vimentin有不正常的甲基化。这些基因是潜在的结直肠癌生物标记物。非细胞外周血中的DNA研究表明，释放到血液中的肿瘤DNA可以作为生物标记物用来检测肿瘤。但目前现有的方法对结直肠癌检测的特异性和灵敏度均较低。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有结直肠癌检测方法特异性和灵敏度低的缺陷，提供一种能够高特异性和灵敏度检测结直肠癌的引物对和试剂盒，以及所述引物对在制备用于检测SEPT9基因甲基化状态的试剂盒中的应用。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种引物对，其中，该引物对包括：如SEQ ID No：1所示的上游引物和如SEQ ID No：2所示的下游引物。另一方面，本专利技术提供了一种检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒，其中，该试剂盒包括：如上所述的引物对和阻拦序列；所述阻拦序列为在对经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA进行PCR扩增的退火过程中，优先于如上所述的引物对特异性结合到未甲基化的SEPT9DNA上，并阻止如上所述的引物对与未甲基化的SEPT9DNA结合的核苷酸序列。再一方面，本专利技术还提供了一种如上所述的引物对在制备用于检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒中的应用。通过上述技术方案，能够有效地提高SEPT9DNA甲基化检测的灵敏度和特异性，其检测的敏感度可高达90%、特异度高达88%。因此，本专利技术的引物和试剂盒能够更好地防治结直肠癌，从而降低结直肠癌对人类健康的危害。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下将对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。一方面，本专利技术提供了一种引物对，其中，该引物对包括：如SEQ ID No：1所示的上游引物（5’-GYGYGATTYGTTGTTTATTAGTTATT-3’）和如SEQ ID No：2所示的下游引物（5’-CCRAAATAATCCCATCCAAC-3’）。其中，Y和R均为退化碱基，Y为C或T，R为A或G。另一方面，本专利技术提供了一种检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒，其中，该试剂盒包括：如上所述的引物对和阻拦序列；所述阻拦序列为在对经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA进行PCR扩增的退火过程中，优先于如上所述的引物对特异性结合到未甲基化的SEPT9DNA上，并阻止如上所述的引物对与未甲基化的SEPT9DNA结合的核苷酸序列。需要指明的是，本文中，所述SEPT9DNA是指SEPT9基因的V2启动子区，研究发现，在结直肠癌的组织样本中，该区域内的甲基化水平最高，而在正常人群或患有其它疾病的人群中，该区域内的甲基化水平最低。因此，检测该区域内DNA的甲基化水平能够有效地进行结直肠癌的诊断。SEPT9DNA的V2启动子区的核苷酸序列如SEQ ID No：17所示（GCGCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTATGTCGGATTTCGCGGTTAACGCGTAGTTGGATGGGATTATTTCGG），其中，该基因中加有下划线的核苷酸为甲基化区域。另外，本专利技术还需要指出的是，所述SEPT9DNA可以是甲基化的SEPT9DNA，也可以是未甲基化的SEPT9DNA，还可以是甲基化的SEPT9DNA和未甲基化的SEPT9DNA的混合SEPT9DNA。所述经亚硫酸氢盐处理的SEPT9DNA是指对上述甲基化的或未甲基化的或混合的SEPT9DNA进行亚硫酸氢盐处理。其中，所述亚硫酸氢盐处理具有本领域公知的含义，也即，所述亚硫酸氢盐处理能够将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而保持所有甲基化的胞嘧啶不变。根据本专利技术，本领域技术人员能够理解的是，在退火的过程中，所述阻拦序列（blocker）优先于如上所述的引物对特异性结合到未甲基化的SEPT9DNA上，是指blocker的复性温度高于所述引物的复性温度，并且blocker只与经亚硫酸氢盐处理的未甲基化的SEPT9DNA相结合。此处“阻止如上所述的引物对与未甲基化的SEPT9DNA结合”是指blocker的序列长度能够部分覆盖如上的引物对在经亚硫酸氢盐处理的DNA模板上的结合区，从而能够阻止引物对与经亚硫酸氢盐处理的未甲基化的SEPT9DNA结合。根据本专利技术，所述blocker的核苷酸序列没有特别的限制，只要其能够具有如上的特性即可。本领域技术人员能够根据本专利技术提供的引物对以及如上的blocker的特性，利用本领域常规的技术手段，得到符合本专利技术要求的blocker。优选的情况下，所述blocker的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示（5'-TCCAACTACACATTAACCACAAAATCCAACATAATAACT-3'），或者为将SEQ ID No：3所示的序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加后仍具有所述blo本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种引物对，其特征在于，该引物对包括：如SEQ ID No：1所示的上游引物和如SEQ ID No：2所示的下游引物。
【技术特征摘要】
1.一种引物对，其特征在于，该引物对包括：如SEQ ID No：1所示的
上游引物和如SEQ ID No：2所示的下游引物。
2.一种检测SEPT9DNA甲基化状态的试剂盒，其特征在于，该试剂盒
包括：权利要求1所述的引物对和阻拦序列；所述阻拦序列为在对经亚硫酸
氢盐处理的SEPT9DNA进行PCR扩增的退火过程中，优先于权利要求1所
述的引物对特异性结合到未甲基化的SEPT9DNA上，并阻止权利要求1所
述的引物对与未甲基化的SEPT9DNA结合的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述阻拦序列为SEQ ID No：
3所示的序列，或者将SEQ ID No：3所示的序列经过一个或多个核苷酸的
取代、缺失或添加后仍具有所述阻拦序列的性能的核苷酸序列；优选地，所
述阻拦序列为SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5、SEQ ID No：
6和SEQ ID No：7所示的序列中的一种或多种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其中，所述试剂盒中还含有荧
光染料和/或SEPT9Taqman探针，所述SEPT9Taqman探针能够在对经亚硫
酸氢盐处理的SEPT9DNA进行PCR扩增的退火过程中，优先于权利要求1
所述的引物对特异性结合到SEPT9DNA的非引物结合处。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，
所述染...
【专利技术属性】
技术研发人员：李劲风，于耕，
申请(专利权)人：北京神源德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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