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基于宫颈癌特异性甲基化检测的引物对、试剂盒及方法技术

技术编号:15516358 阅读:78 留言:0更新日期:2017-06-04 07:23
本发明专利技术涉及一种基于宫颈癌特异性甲基化检测的引物对。所述引物对包括PAX1正向引物、反向引物及检测探针,ACTB正向引物、反向引物及检测探针。本发明专利技术涉及一种基于宫颈癌特异性甲基化检测的试剂盒。所述试剂盒包括含有上述引物及探针的PCR反应液,其包括PAX1正向引物、PAX1反向引物、PAX1检测探针,ACTB正向引物、ACTB反向引物、ACTB检测探针,10×PCR buffer,dNTP、无核酸酶水及Ex Taq酶。本发明专利技术还涉及一种基于宫颈癌特异性甲基化检测的方法。本发明专利技术提供的试剂盒及其检测方法具有检测结果准确、检测通量高、特异性好、灵敏性好、检测时间快速、使用方便并能有效满足临床要求的优点。

【技术实现步骤摘要】
基于宫颈癌特异性甲基化检测的引物对、试剂盒及方法
本专利技术涉及体外诊断
,特别的,涉及一种基于宫颈癌特异性甲基化检测的引物对、试剂盒及方法。
技术介绍
宫颈癌是最为常见的妇科恶性肿瘤之一,是危害女性健康与生命的主要疾病。流行病学调查显示,每年全球有46.5万宫颈癌新发病例,其中中国每年约有13万新发病例。目前宫颈癌的发病年龄趋于年轻化,受宫颈癌侵害的女性多处于生儿育女及经营家庭的黄金时期。宫颈癌不同于其他肿瘤,疾病自然史明确,有一系列的癌前病变,它的发生和发展是由量变到质变、渐变到突变,要经历几年到十几年的过程。因此,宫颈癌的防治关键在于通过筛查及时发现和治疗宫颈病变,终止其向宫颈癌的发展。因而,早发现、早诊断及早治疗对于提高宫颈癌治疗效果具有重大意义。目前采用的宫颈癌常规筛查技术包括:巴氏涂片法:该技术灵敏度低,特异性一般,检测方法人为干扰因素较大,结果准确性有限及成本低;液基薄层细胞学检测(Thin-CytologicTest,TCT):该技术灵敏度低,特异性高,检测方法需要人工观察分析且易干扰,对非典型鳞状细胞诊断率不高,无法检查宫颈腺癌;HPV-DNA检测:该技术灵敏度高,特异性低,检测方法通量高,适用于大规模临床筛查,但是假阳性率高,只能预警而非早期发现;HPV-E6E7mRNA检测:该技术灵敏度高,特异性一般,检测方法分型体系复杂,RNA不稳定,检测的是病毒而非个体基因,也只能预警而非早期发现。上述这些方法均存在操作繁琐、假阳性率高、灵敏度低等缺点,限制了其在临床实验室的准确筛查。近期宫颈癌DNA甲基化研究表明,PAX1的DNA甲基化改变与宫颈癌的病情进展相关联。PAX1基因在宫颈癌变的发生机制中起到潜在的抑癌作用,PAX1基因的高甲基化可以促进宫颈癌的发生。因此检测宫颈癌PAX1基因启动子的甲基化状态,对宫颈癌的筛查具有重要的意义。目前,传统的甲基化检测方法包括:甲基化特异性PCR及亚硫酸氢盐测序法。然而这些方法存在操作繁琐、准确性低及敏感性不高的缺点,限制了其在临床实验室的广泛应用。因此,有必要提供一种新的宫颈癌PAX1基因的甲基化检测方法来克服上述缺陷。
技术实现思路
为了解决上述传统甲基化检测方法存在操作繁琐、准确性低及敏感性不高的技术问题,本专利技术提供一种操作简单、准确性高及敏感性高且基于荧光PCR技术的基于宫颈癌特异性甲基化检测的引物对、试剂盒及其方法。本专利技术提供了一种基于宫颈癌特异性甲基化检测的引物对,包括针对PAX1基因和ACTB基因的启动子区的特异性引物及探针,如下:PAX1正向引物:5'-GTGGAGAGTGTTTTGGGAGGG-3'(SEQIDNO.1),PAX1反向引物:5'-CTACCRCCCRCTCCAAAACC-3'(SEQIDNO.2),PAX1检测探针:5'FAM-TAGTAGCGGCGGCGGT-3'MGB(SEQIDNO.3);ACTB正向引物:5'-GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT-3'(SEQIDNO.4),ACTB反向引物:5'-ATCATCTTTCCCACCAAACTATAACC-3'(SEQIDNO.5),ACTB检测探针:5'VIC-CCCATTAACTAAACACAACCT-3'MGB(SEQIDNO.6)。本专利技术还提供了一种基于宫颈癌特异性甲基化检测的试剂盒,包括含有如上述引物及探针的PCR反应液,所述PCR反应液包括:PAX1正向引物、PAX1反向引物、PAX1检测探针,ACTB正向引物、ACTB反向引物、ACTB检测探针,10×PCRbuffer,dNTP及无核酸酶水。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中,所述试剂盒还包括ExTaq酶。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中,所述PCR反应液的成分终浓度为:1×PCRbuffer,0.4μMPAX1正向引物、0.4μMPAX1反向引物、0.4μMPAX1检测探针,0.4μMACTB正向引物、0.4μMACTB反向引物、0.4μMACTB检测探针,0.25mMdNTP。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中,所述试剂盒还包括阳性对照品及阴性对照品,所述阳性对照品为甲基化标准品DNA,所述阴性对照品为非甲基化标准品DNA。其中所述甲基化标准品DNA如SEQIDNO.7所示:AAATTGATTttCGtACGtTGtAGttTttCGGTtAGACGAATTTtTtttAATCGGATGAAGTTtAtttTGGGttTGGGGTCGCGGGCGTGGAGAGTGTttTGGGAGGGGGtAGtAGCGGCGGCGGtAGGtttTGGAGCGGGCGGtAGCGCGtTtCGtTGtCGCGtAtAGCGCGTtTttAGttCGCGGtTGGGtCGtCGCGGtTtTCG;所述非甲基化标准品DNA如SEQIDNO.8所示:AAATTGATTtttGtAtGtTGtAGttTtttGGTtAGAtGAATTTtTtttAATtGGATGAAGTTtAtttTGGGttTGGGGTtGtGGGtGTGGAGAGTGTttTGGGAGGGGGtAGtAGtGGtGGtGGtAGGtttTGGAGtGGGtGGtAGtGtGtTttGtTGttGtGtAtAGtGtGTtTttAGtttGtGGtTGGGttGttGtGGtTtTtGGt。本专利技术还提供了一种基于宫颈癌特异性甲基化检测的方法,包括如下步骤:步骤一:取待检测样本抽提的DNA,对其进行转化处理,转化后的DNA作为PCR的模板;步骤二:提供上述基于宫颈癌特异性甲基化检测的试剂盒,对所述模板进行PCR扩增;步骤三:根据PAX1与ACTB基因PCR扩增结果的相对荧光CT值来确定待检测样本的甲基化率,即待检测样本中PAX1/ACTB的比值除以阳性对照品中PAX1/ACTB的比值。在本专利技术提供的所述方法的一种较佳实施例中,所述步骤一中转化处理所采用的试剂为亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐。在本专利技术提供的所述方法的一种较佳实施例中,所述步骤二中PCR扩增反应程序为:95℃变性10min;50cycles,95℃15sec,60℃30sec。相较于现有技术,本专利技术提供的基于宫颈癌特异性甲基化检测的引物对、试剂盒及方法的有益效果在于:通过设计特异性高的引物及探针,并配置成使用方便且检测结果可靠的试剂盒,再设计出科学合理的PCR反应体系,使得本专利技术具有快速、高通量、灵敏及特异性好的特点,实现对宫颈癌PAX1基因的甲基化程度快速及准确测量,以便对宫颈癌间接进行及时、有效的诊断和治疗,降低医疗成本,节约社会资源。附图说明图1为针对不同甲基化率样本的PCR扩增曲线图;图2为利用本专利技术引物对及试剂盒所能检测出的最低检出限的PCR扩增曲线图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白,下面结合附图及实施例,对本专利技术进行进一步的详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术,并不用于限定本专利技术。实施例1:试剂盒的制备一、引物和探针的设计与合成针对人基因组中PAX1基因和内标基因ACTB(β-actin)的启动子区(序列参见NCBI数据库公开的人类全基因组序列),使用PrimerPremier3.本文档来自技高网
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基于宫颈癌特异性甲基化检测的引物对、试剂盒及方法

【技术保护点】
一种基于宫颈癌特异性甲基化检测的引物对,其特征在于,包括针对PAX1基因和ACTB基因的启动子区的特异性引物及探针,如下:PAX1正向引物:5'‑GTGGAGAGTGTTTTGGGAGGG‑3',PAX1反向引物:5'‑CTACCRCCCRCTCCAAAACC‑3',PAX1检测探针:5'FAM‑TAGTAGCGGCGGCGGT‑3'MGB;ACTB正向引物:5'‑GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT‑3',ACTB反向引物:5'‑ATCATCTTTCCCACCAAACTATAACC‑3',ACTB检测探针:5'VIC‑CCCATTAACTAAACACAACCT‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种基于宫颈癌特异性甲基化检测的引物对,其特征在于,包括针对PAX1基因和ACTB基因的启动子区的特异性引物及探针,如下:PAX1正向引物:5'-GTGGAGAGTGTTTTGGGAGGG-3',PAX1反向引物:5'-CTACCRCCCRCTCCAAAACC-3',PAX1检测探针:5'FAM-TAGTAGCGGCGGCGGT-3'MGB;ACTB正向引物:5'-GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT-3',ACTB反向引物:5'-ATCATCTTTCCCACCAAACTATAACC-3',ACTB检测探针:5'VIC-CCCATTAACTAAACACAACCT-3'。2.一种基于宫颈癌特异性甲基化检测的试剂盒,其特征在于,包括含有如权利要求1所述的特异性引物及探针的PCR反应液,所述PCR反应液包括:PAX1正向引物、PAX1反向引物、PAX1检测探针,ACTB正向引物、ACTB反向引物、ACTB检测探针,10×PCRbuffer,dNTP及无核酸酶水。3.根据权利要求2所述的基于宫颈癌特异性甲基化检测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括ExTaq酶。4.根据权利要求2所述的基于宫颈癌特异性甲基化检测的试剂盒,其特征在于,所述PCR反应液的成分终浓度为:1...

【专利技术属性】
技术研发人员:韩林志肖芳李书
申请(专利权)人:韩林志
类型:发明
国别省市:湖南,43

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