本发明专利技术公开了SFRP4基因启动子区多CG位点甲基化检测的引物和方法包括：(1)扩增SFRP4基因启动子区的正、反向兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2；(2)上述引物扩增的目标序列包括至少5个CG位点；(3)针对石蜡切片DNA片段化严重，而亚硫酸氢盐修饰饱和状态下仍呈现有效模板浓度低的问题，将Touch‑down PCR扩增和Sanger测序相结合，可显著提高检测灵敏度。本发明专利技术具有特异性高，准确度高以及低污染风险等优点，可检测肿瘤患者手术石蜡切片SFRP4基因启动子区多个CG位点甲基化，结果可指导医生进行相关疾病的预后评估。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生命科学和生物
，是一种检测SFRP4基因启动子甲基化状态的引物和检测方法。
技术介绍
SFRPs(Secreted Frizzled-related Proteins)为分泌型蛋白质，全称为分泌型卷曲相关蛋白，该家族成员SFRP1-5一样，大约由300多个氨基酸组成，含有一个信号肽、氨基端附近的CRD区域、一个亲水羧基端。CRD区域大约由110个氨基酸残基组成，该区域内含有10个高度保守的半胱氨酸，与Frizzled胞外CRD区域有30-40％的同源性。作为分泌型蛋白质，SFRPs均无Frizzled的7次跨膜区域(Frizzled即通该区域被固定在细胞膜上)，主要位于细胞膜表面或基质中。由于没有跨膜区域，因此SFRP4无法进行Wnt信号向细胞内的转导过程。研究者采用荧光标记4.1kb的含有SFRP4编码序列的基因组片断进行原位杂交，显示人类SFRP基因位于8p21。在对其它生物的检测中，他们发现SFRP4基因存在于猴、猪、蟾蛛等，而在果蝇、酵母等生物没有检出。结果提示SFRP4在脊椎动物高度保守，无脊椎动物却不存在该基因。SFRP4在胚胎发育过程中的表达具有独特时空特点，且其表达亦具有组织特异性，于心脏、肾脏、肠道及脑部表达较多。近年的研究发现，SFRP4基因启动子区的高甲基化导致基因沉默可能与多种肿瘤的发生有关，在结肠癌、宫颈腺癌、子宫颈癌、胰腺癌、大肠癌、间皮瘤、食管鳞癌、贲门腺癌等肿瘤中都发现了SFRP4基因启动子区的高甲基化。国外有相关文献报道在宫颈癌HeLa3rd和CaSki细胞中存在SFRP4的表达缺失，SFRP4在HeLa3rd和CaSki细胞中高度甲基化。对侵袭性乳腺癌中SFRP4的表达情况进行研究，发现80％的病例存在sFRP4表达消失。研究者在对结肠癌的研究中发现SFRP1、2、3、4存在启动子高度甲基化。原发性结直肠癌甲基化频率82％，76％患者SFRP4表达下调，研究显示SFRP4表达下调主要由于其启动子甲基化所致。其他一些学者在另外一些原发性肿瘤中亦检测出SFRP4甲基化及表达消失，包括卵巢癌、食管癌、前列腺癌、肺癌。研究者在进一步的研究中发现结直肠癌癌前病变、腺瘤也存在SFRP4甲基化和表达下调。此外由于瘤旁组织亦存在表达减少，提示SFRP4表达被抑制发生在一定的粘膜区域内而不是单个细胞。所有这些研究显示，SFRP4基因突变在肿瘤中并不常见。而SFRP4在多种肿瘤中则存在较高频率的甲基化及表达下调。研究显示SFRP4在乳腺癌中表达下调，与肿瘤的侵袭有关，SFRP4表达多的淋巴结转移少，与不良预后相关。研究者也发现：SFRP4表达消失是原发性乳腺癌早期事件，多变量分析证实肿瘤分期与SFRP4表达相关性，SFRP4表达消失在乳腺癌早期阶段与不良预后相关。因此，SFRP4表达在乳腺癌常见且可被作为一种新的预后标志物在乳腺癌的早期阶段。目前对于SFRP4启动子甲基化检测的常规方法有：甲基化特异性PCR(MSP)、亚硫酸氢盐焦磷酸测序、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)，甲基化特异性PCR(MS-PCR)等。其中MSP法是使用PCR扩增检测来判断样本是否存在甲基化，该法实用且普遍，但假阳性较高，稳定性较差；亚硫酸氢盐焦磷酸测序因其操作繁琐，因此不适合大批量检测；MS-HRM是通过将单碱基序列的差异转变成熔解曲线的差异，从而判断是否存在甲基化，这种方法对仪器的要求颇高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪，同时该法只能分析检测片段整体甲基化状态，而不能明确每个CG位点的甲基化状态；MS-PCR是基于PCR开发的技术，主要是在检测中加入了TaqMan探针，从而保证了较高的灵敏度和准确度，但其对于多个甲基化位点的检测，也只能做到整体化分析，同时探针成本较高，因此该法较适用于少数位点大量样本检测。本专利技术采用Touch-down PCR扩增和Sanger测序法SFRP4启动子甲基化检测，针对石蜡切片DNA片段化严重，在造成亚硫酸氢盐处理饱和的情况下，仍出现的有效模板浓度很低的情况，Touch-down PCR扩增可确保正、反向扩增引物与样本DNA模板的结合发生在最互补的序列之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异性扩增产物在此时已经有一个几何数的起始优势，丰度较高，在剩余的扩增反应中，特异性扩增产物与非特异扩增产物产生竞争，但是因非特异性扩增产物丰度较低，特异性扩增产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。而Sanger测序法是检测基因突变的金标准，检测结果准确性高，并且很大程度上地节省了检测成本。由于DNA序列在经亚硫酸盐处理后，其部分C碱基会转变为T，导致序列区域内CG含量和TM值发生较大程度的变异，进而影响常规引物设计软件在其序列上获得理想的引物序列。因此，本专利技术中PCR采用的扩增引物以及测序引物均为自行设计，其中测序引物使用兼并碱基，从而使得阴性、阳性都可在同一体系扩增。同时，扩增引物的使用比例经过多次优化实验，相对于其它文献和软件设计的引物具备了更加理想的扩增效率。因此，本专利技术的检测方法具备了检测出率高，检测稳定性好，准确度高以及低污染风险等优势。检测结果将有助于预见相关肿瘤疾病的早期，同时具有潜在的指导临床医生个体化治疗的作用。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：设计用于检测SFRP4基因启动子甲基化的引物，包括一对特异性扩增兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其序列为：SEQ NO 1：5’-CGGAGTTCGGGATTGGAGTTGTT-3’；SEQ NO 2：5’-CTTCCTACCACCCTCATCTTTCGCTA-3’；所述SEQ NO 1和SEQ NO 2也可作为测序引物。本专利技术提供的另一个技术方案是：用于检测SFRP4基因启动子甲基化的方法，包括：(1)提取样本中的DNA；(2)将步骤(1)中提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理；(3)以步骤(2)中的DNA作为模板，使用SEQ NO1和SEQ NO 2扩增SFRP4基因片段，获得PCR扩增产物；(4)对步骤(3)中获得的产物测序；(5)根据步骤(4)的测序结果，得到序列CG位点的甲基化结果；其中，PCR扩增反应条件为：第一阶段，92-97℃预变性5-15min；第二阶段，变性温度92-97℃30sec，退火温度62-66℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环12-18次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度92-97℃30sec，退火温度53-57℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24-34次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。所述的测序为Sanger测序，测序引物为：SEQ NO 1：5’-CGGAGTTCGGGATTGGAGTTGTT-3’；SEQ NO 2：5’-CTTCCTACCACCCTCATCTTTCGCTA-3’；该方法检测的样本为石蜡切片样本、全血样本、新鲜组织样本或细胞系样本。更进一步地，本专利技术提供一种用于检测SFRP4基因启动子甲基化的试剂盒的技术方案，包括亚硫酸盐修饰、PCR扩增试剂以及Sanger测序试剂、阳性对照品、本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测SFRP4基因启动子甲基化的引物，其特征在于，包括一对特异性扩增兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其序列为：SEQ NO 1：5’‑CGGAGTTCGGGATTGGAGTTGTT‑3’；SEQ NO 2：5’‑CTTCCTACCACCCTCATCTTTCGCTA‑3’。
【技术特征摘要】
1.用于检测SFRP4基因启动子甲基化的引物，其特征在于，包括一对特异性扩增兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其序列为：SEQ NO 1：5’-CGGAGTTCGGGATTGGAGTTGTT-3’；SEQ NO 2：5’-CTTCCTACCACCCTCATCTTTCGCTA-3’。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，扩增引物同为测序引物，所述测序引物的序列为：SEQ NO 1：5’-CGGAGTTCGGGATTGGAGTTGTT-3’；SEQ NO 2：5’-CTTCCTACCACCCTCATCTTTCGCTA-3’。3.一种用于检测SFRP4基因启动子甲基化的方法，包括：(1)提取样本中的DNA；(2)将步骤(1)中提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理；(3)以步骤(2)中的DNA作为模板，使用SEQ NO1和SEQ NO 2扩增SFRP4基因片段，获得PCR扩增产物；(4)对步骤(3)中获得的产物测序；(5)根据步骤(4)的测序结果，得到序列CG位点的甲基化结果；其所述引物序列为：SEQ NO 1：5’-CG...
【专利技术属性】
技术研发人员：林有升，单战，王淑一，
申请(专利权)人：上海艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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