可用于检测与2型糖尿病相关的PTPN1基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了可用于检测与2型糖尿病相关的PTPN1基因甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对PTPN1基因甲基化特异性扩增引物及甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对女性人群2型糖尿病的检测，检测效率高，针对性强，同时，以PTPN1基因甲基化为靶点的药物有望成为2型糖尿病辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测 与2型糖尿病相关的/77W7基因启动子区甲基化程度的试剂盒。
技术介绍
糖尿病（diabetes mellitus)是一种慢性代谢性疾病，是血中胰岛素绝对或相 对不足，导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱，临床上可出现多尿、烦 渴、多饮、多食，消瘦等表现，重者容易发生酮症酸中毒等急性并发症或血管、神经等慢性并 发症。糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病，其患病率随着生活条件的改善生活水平提 高都呈逐渐增长的趋势。据统计，目前中国糖尿病患病人数接近一亿，患病率高达9. 7%。糖 尿病不是单一疾病，是由遗传及环境因素在内的多种因素共同作用的结果。其中2型糖尿 病发病人数约占糖尿病总发病人数的97%。截至目前尽管能从遗传的角度证实不同基因的 表达能引起个体对2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus, T2DM )的易感性不同，相关 候选基因的单核苷酸多态性与T2DM的发生也具有关联性，然而遗传因素和环境因素等病 因对T2DM发病机制仍未被完全阐释清楚，这无疑妨碍了 T2D预防及治疗水平的提高。 蛋白酪氨酸磷酸酶 Nl( protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 1，尸77?￥/)基因位于人类染色体20ql3. 1能够编码蛋白酪氨酸磷酸酶1B( protein tyrosine phosphataselB，PTPlB)。PTP1B 是蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases， PTPs)家族中的一员，广泛存在于人肾脏、脾、肌肉、心、肝、脑等组织的细胞质内质网表面。 国内外已有大量研究表明在PTP1B主要是通对胰岛素受体激酶或其活性片段和胰岛素受 体底物-1、瘦素信号通路JAK2/STAT3、糖酵解途径的丙酮酸激酶等磷酸化酪氨酸残基去磷 酸化作用，从而参与胰岛素、瘦素、能量代谢等信号传导通路的负调控。经研究发现，PTP1B 与T2DM和肥胖的发生、发展有密切关系，被认为是治疗T2DM和肥胖症的一个重要潜在靶 点。也有研究报道了尸77^7基因单核苷酸多态性与T2DM发病的关系在不同人群、不同位点 的基因突变意义不同，且研究多集中于Pr〇387L、C981T和1484insG等多态位点。目前，国 内外还没有公开任何关于检测2型糖尿病相关/77W7基因启动子区甲基化程度的试剂盒相 关研究报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可用于检测与2型糖尿病相关的/77W7基 因甲基化程度的试剂盒及其应用，其中尸77^/基因甲基化水平与女性人群2型糖尿病患病 率呈正相关，检测效率高，针对性强。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可用于检测与2型糖尿病相 关的/77W7基因启动子区甲基化程度的试剂盒，该试剂盒包括/77W7基因启动子区的甲基 化特异性扩增上游引物及其甲基化特异性扩增下游引物和甲基化特异性测序引物，其中 所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示： 5' _ TAGGGGTAGGGGATTGTA -3'， 所述的甲基化特异性下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示： 5' - Biotin-CTCCTTTTCCATCTCCATA -3'， 所述的甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO. 3所示： 5' - TTTTCCATCTCCATAA -3'。 上述可用于检测与2型糖尿病相关的/77W7基因启动子区甲基化程度的试剂盒的 应用，该试剂盒可用于2型糖尿病辅助检测、诊断或药物治疗中。 上述可用于检测与2型糖尿病相关的/77W7基因启动子区甲基化程度的试剂盒的 应用，该试剂盒可用于女性人群2型糖尿病辅助检测、诊断或药物治疗中。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术首次公开了可用于检测与2型糖 尿病相关的尸77^/基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，该检测试剂盒包含一对 /77W7基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，/77W7基因启 动子区高甲基化水平导致尸77^/基因的低表达，参与胰岛素、瘦素、能量代谢等信号传导通 路的调控，从而影响2型糖尿病的发生和发展。因此，/77W7基因启动子区甲基化水平与2 型糖尿病的患病率呈正相关，通过检测尸77^/基因启动子区甲基化程度辅助诊断糖尿病， 简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于的 糖尿病的早期预防、早发现和及时治疗。 综上所述，以/77W7基因启动子区域甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快 捷地在分子水平上实现对2型糖尿病的检测，同时，以/77W7基因启动子区域DNA甲基化为 靶点的药物有望成为2型糖尿病辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。【附图说明】 图1为/77W7基因被检测序列所在区域(具体位置为Chr20:49126957-49127083) 及所检测的8个CpG点的相关性不意图； 图2为/77W7基因甲基化水平检测结果示意图（图中所示百分数为对应CpG位点的甲 基化程度，如图示有CpGl到CpG8的甲基化程度分别为4%，3%，4%，10%，5%，4%，5%，5%)。【具体实施方式】 以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。 具体实施例 1、研究对象的收集 从深圳市某慢性病研究所收集2型糖尿病患者标本，2型糖尿病诊断标准依据2010年 美国糖尿病协会(ADA)指南，排除高血压、冠心病等心脏疾病、肾功能不全、药物滥用、肥胖 或其他严重的疾病等疾病后，最后确定T2D97例作为病例组（59. 79±9. 39岁），同时收集年 龄、性别、BMI相匹配且无其他疾病的97名正常者作为对照组（59. 79±9. 39岁）。对所有研 究对象在知情同意的前提下，抽血测总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、尿素和肌酐等一 般生化指标，同时抽取静脉血3ml入EDTA抗凝管中，-80°C低温储存，以备用于标本统一提 取基因组DNA。 2、基因组DNA的提取 应用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪（中国厦门，致善生物科技）提取上述步骤得到 的样本的全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计（美国，Thermo Fisher Scientific)检测所得DNA的浓度，以供如7基因和/77W7基因启动子区DNA甲基化水平 的检测。 3、DNA甲基化水平测定 本研究采用焦磷酸测序技术对基因启动子区8个CpG位点(如图1所示)进行了DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链 反应（PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶（C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变 成了尿嘧啶（U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次 研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计， 用于实验的尸77^/基因启动子区甲基化扩增引物和测序引物如下： (1) 甲基化特异性上游引物（Forward primer) 5' - TAGGGGTAGGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可用于检测与2型糖尿病相关的PTPN1基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括PTPN1基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物及其甲基化特异性扩增下游引物和甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’‑ TAGGGGTAGGGGATTGTA ‑3’，所述的甲基化特异性下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’‑ Biotin‑CTCCTTTTCCATCTCCATA ‑3’，所述的甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示：5’‑ TTTTCCATCTCCATAA ‑3’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩丽媛，段世伟，麦一峰，黄清，周恩呈，刘艳芬，陆南佳，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33