转基因大豆MON87769的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因大豆MON87769的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。引物组由6条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1~6所示。检测试剂盒包括检测引物溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶、10×反应缓冲液、dNTPs溶液、显色剂。检测方法是采用特异性引物及具有链置换活性的DNA聚合酶，在63~65℃对样品DNA模板进行扩增，并采用加入显色剂观察颜色变化的方法，判断样品是否含有转基因大豆MON87769成分。本发明专利技术不需要特殊仪器，具有快速高效、操作简便、特异性强等特点，适合现场检测。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 转基因大豆M0N87769的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方 法
本专利技术属于分子生物学
，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测转基因大豆M0N87769的引物组、试剂盒和检测方法。
技术介绍
2014年全球转基因作物种植面积高达1.815亿公顷，比1996年商业化初期增长了100余倍。目前商业化种植的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜，其中全球种植面积最大的为转基因大豆，2014年达到9070万公顷，占全球转基因作物总面积的50%。转基因大豆M0N87769是美国孟山都公司研发的一种品质改良转基因大豆新品种，已在我国申请进口用作加工原料。针对转基因大豆M0N87769开展快速精准的检测方法研究，是转基因生物安全管理相关法律法规顺利实施的技术支撑和保障。转基因成分检测技术主要分为两大类:一类以外源DNA为检测对象，如PCR、基因芯片等，另一类以外源基因表达的蛋白质为检测对象，如ELISA、免疫试纸条等。在上述方法中，目前PCR技术应用最为广泛，但基于PCR的转基因检测方法需要PCR仪、凝胶成像系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长(约3~4 h)，难以达到现场快速检测目的，因此，在实际工作中需要一种更加便捷、准确、且适用于现场操作的转基因检测新技术。LAMP技术是由日本荣研化学株式会社在2000年开发的一种新的基因扩增技术，该技术的基本特点是:①恒温扩增:整个扩增反应在恒温条件(60~65°C)进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效:整个扩增和产物检测可在I h内完成；③高特异性:针对靶标序列的6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高；④高灵敏度:检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便:可通过肉眼或浊度仪观察反应管内的沉淀变化，或在反应管中加入染色剂后通过肉眼观察颜色变化等方法，对扩增产物进行便捷的检测。LAMP方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因植物检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用LAMP方法检测转基因大豆M0N87769的检测方法和试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于公开一种转基因大豆M0N87769的LAMP检测引物组。本专利技术的另一个目的在于公开一种转基因大豆M0N87769的LAMP检测试剂盒。本专利技术的另一个目的在于公开一种基于上述引物组和试剂盒检测转基因大豆M0N87769的LAMP检测方法。本专利技术所采用的技术方案如下:根据转基因大豆M0N87769的转化体特异性的核苷酸序列，设计转基因大豆M0N87769的LAMP检测引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1-6 ;确定LAMP检测方法的技术参数，并对检测方法的特异性进行验证。转基因大豆M0N87769的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，其核苷酸序列分别如下所示:外引物 F3:GTAGATTTCCCGGACATGAA (SEQ ID NO:I)；外引物 B3:TCTTGACATTCTTCAAACAATCA (SEQ ID NO:2)；内引物 FIP:TCGACACTTGTCTTTTCTTTCTCTTTTTTACAATTGACCATCATACTCAA (SEQ ID NO:3)；内引物 BIP:TACACTTTAGATGCAACAAGCCTTCTTTAAAAGCAAGCAATTGAATTTGG (SEQ ID NO:4)；环引物 LF:TTAGCAAGTTGCTCGTGAAGTT (SEQ ID NO:5);环引物 LB:AATGGGCCATGAAGATGGTTT (SEQ ID NO:6)。转基因大豆M0N87769的LAMP检测试剂盒，包括以下组分: (1)检测引物溶液:由上述6条引物配制的检测引物溶液，外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB的浓度依次为4~6 Mmol/L,4-6 Mmol/L,32-48Mmol/L、32~48 Mmol/L、4~6 Mmol/L和 4~6 Mmol/L ； (2)具有链置换活性的DNA聚合酶:浓度为7?9U/ μ L ; (3)1X 反应缓冲液:200 mmol/L Tris-HCU pH 8.8，100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4)2SO4,40-100 mmol/L MgSO4,6-14 mol/L 甜菜碱； (4)dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP, dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成； (5)显色齐IJ:1000XSYBR GREEN I 荧光染料。优选的，所述的检测引物溶液中含有5 Mmol/L外引物F3、5 Mmol/L外引物B3、40Mmol/L 内引物 FIP、40 Mmol/L 内引物 BIP、5 Mmol/L 环引物 LF、5 Mmol/L 环引物 LB。优选的，所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8 U/μ L0优选的，所述的10Χ反应缓冲液中MgSO4、甜菜碱的浓度分别为80 mmol/L和8mol/L。利用以上所述的试剂盒检测转基因大豆M0N87769的方法，包括如下步骤: (1)提取待测样品的基因组DNA； (2)配制待测样品的LAMP检测反应体系:在200μ L PCR反应管内加入模板DNA 2-5yL、检测引物溶液I yL、Bst DNA聚合酶I μ L、10 X反应缓冲液2.5 μ UdNTPs溶液2~5μ L，用灭菌去离子水或超纯水补齐至总体积为25 μ L ; (3)运行LAMP扩增反应:63~65°C孵育30~60min，80°C孵育5min终止反应； (4)LAMP扩增结果的鉴定:在反应管中加入1~2μ L显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。通过实验证明，本专利技术提供的转基因大豆Μ0Ν87769的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强等优点。【附图说明】图1是实施例2中进行特异性检测的结果图，1-17依次为转基因大豆M0N87701、M0N87705、M0N87708、M0N87769、非转基因大豆对照、转基因大豆混合样品SI (含有M0N87701、M0N87705、M0N87708、M0N87769)、转基因大豆混合样品 S2 (含有 M0N87701、M0N87705、M0N87708、M0N87769)、转基因大豆混合样品 S3 (含有 M0N87701、M0N87705)、转基因大豆混合样品S4 (含有M0N87708、M0N87769)、转基因大豆混合样品S5 (含有M0N89788、40-3-2、A5547、A2704、305423、356043、CV127)、转基因玉米混合样品 S6 (含有 Btll、Btl76、M0N810、MON863、NK603、GA21、TCl507、T25 )、转基因水稻混合样品 S7 (含有 KF-6、TT51-1)、转基因棉花混合样品S8 (含有MON531、MON1本文档来自技高网...

【技术保护点】
转基因大豆MON87769的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，其核苷酸序列分别如下所示：外引物F3：GTAGATTTCCCGGACATGAA（SEQ ID NO：1）；外引物B3：TCTTGACATTCTTCAAACAATCA（SEQ ID NO：2）；内引物FIP：TCGACACTTGTCTTTTCTTTCTCTTTTTTACAATTGACCATCATACTCAA（SEQ ID NO：3）；内引物BIP：TACACTTTAGATGCAACAAGCCTTCTTTAAAAGCAAGCAATTGAATTTGG（SEQ ID NO：4）；环引物LF：TTAGCAAGTTGCTCGTGAAGTT（SEQ ID NO：5）；环引物LB：AATGGGCCATGAAGATGGTTT（SEQ ID NO：6）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李飞武，闫伟，夏蔚，邵改革，龙丽坤，李葱葱，刘娜，董立明，邢珍娟，张明，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：吉林;22