【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学检测方法，更具体的说是涉及一种胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法。
技术介绍
胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）是胶质瘤发性胶质瘤细胞的重要促生长因子，在原发性胶质瘤组织和多种胶质瘤细胞系中转录异常升高。目前，基因高转录对胶质瘤细胞恶性增殖与迁移机制的研究已经很多，然而鲜见对其高转录发生机制的报道。本课题组前期的研究发现，gdnf 基因的高转录与基因突变无关，推测基于非DNA 序列改变的表观遗传修饰可能参与其高转录调控过程。近来的研究表明，翻译后组蛋白的乙酰化修饰在调节基因转录过程中发挥了重要作用。通过现有技术的发展，GDNF 基因 mRNA表达及其启动子Ⅰ区组蛋白 H3K9 的乙酰化修饰状态，GDNF 基因 上mRNA与基因癌变有重要关系，现有技术中也有记载检测GDNF 基因 上mRNA的方法，但是现有技术中的方法由于受到外界影响过大，检测出来的未定型不高。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种高稳定性胶质瘤细胞中GDNF基因启动子mRNA检测方法。为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种胶质瘤细胞...
【技术保护点】
一种胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于：步骤一：提取胶质瘤细胞：取48h内的胶质瘤样本，首先剪碎并用清洗，加入0.25 %胰酶溶液在37℃条件下消化5min；收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，每周换液两次；在原代培养7‑9天后，将培养瓶置于恒温摇床37℃，200rpm，20h震荡纯化，以去除小胶质细胞及少突胶质细胞；经GFAP 免疫荧光鉴定阳性的细胞视为成熟的细胞，取第4代的处于对数生长期为胶质瘤细胞株；步骤二：细胞培养：胶质瘤细胞株用含10%胎牛血清、100U/ml 青霉素，100U/ml链霉素的培养基，置于37℃，5% CO2培养...
【技术特征摘要】
1.一种胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于：步骤一：提取胶质瘤细胞：取48h内的胶质瘤样本，首先剪碎并用清洗，加入0.25 %胰酶溶液在37℃条件下消化5min；收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，每周换液两次；在原代培养7-9天后，将培养瓶置于恒温摇床37℃，200rpm，20h震荡纯化，以去除小胶质细胞及少突胶质细胞；经GFAP 免疫荧光鉴定阳性的细胞视为成熟的细胞，取第4代的处于对数生长期为胶质瘤细胞株；步骤二：细胞培养：胶质瘤细胞株用含10%胎牛血清、100U/ml 青霉素，100U/ml链霉素的培养基，置于37℃，5% CO2培养箱中培养；步骤三：药物处理：取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行药物处理，加入终浓度为25~100μmol/L的姜黄素继续培养24h；步骤四：mRNA提取，采用TRIzol一步法从细胞中提取总 RNA，取RNA模板2μg用Prime Script II逆转录试剂盒行逆转录反应合成cD-NA第一链，再以逆转录反应液1μl作为模板，加入相应引物进行PCR扩增，所述引物的序列为：GAPDH：F:5’ TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3’ R:5’ AGATCCACAACGGATACATT3’GDNF: F:5’ GACTTGGGTTTGGGCTACGA3’ R:5’ TGGTAAACCAGGCTGTCGTC3’；步骤五：反应：95 ℃预变性30s；95℃变性20S，60℃退火15s; 72℃延伸15s，扩增40个循环；步骤六：计算：样品以GAPDH 基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量 (2^-△△CT) 法计算目的基因在各样品中相对mRNA的表达水平。2.根据权利要求1所述的大鼠 C6 胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于：所述步骤一中，在将样本剪碎后，通过75%的酒精进行一次清洗，之后通过清洗液中浸泡15min后，在用清洗液冲洗至少三次，所述清洗液包括下列重量份组成：去离子水 800~1000份氯化钠 5~10份氯化钾 0.1~1份磷酸二氢钾 0.1~1份磷酸氢二钠 1~2份磷酸甘油 1~2份海藻糖 0.1~1份；再加入0.25 %胰酶溶液在37℃条件下消化5min，所述胰酶溶液包括：0.25%的胰酶、0.02%的EDTA、0.02%的海藻糖、5%的丙三醇、0.5%的磷酸甘油，余量为PBS缓冲液。3.根据权利要求1所述的胶质瘤细...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈茂华，孙军，陆川，陈献东，巴华君，蔡建勇，
申请(专利权)人：温州市中心医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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