本发明专利技术涉及一种神经胶质瘤全肿瘤抗原及其制备方法，其制备方法包括以下步骤：获取神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞，将两者混合后进行细胞裂解后，离心去上清，即获得神经胶质瘤全肿瘤抗原。采用神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞制备的神经胶质瘤全肿瘤抗原较现有神经胶质瘤抗原携带的抗原信息较多较全，因此采用本发明专利技术提供的神经胶质瘤全肿瘤抗原所制备的疫苗，不仅能杀死神经胶质瘤干细胞，而且还能够杀死神经胶质瘤肿瘤细胞，杀瘤率较高，且免疫原性较强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程和生物医药领域，特别涉及神经胶质瘤全肿瘤抗原及其制备方法。
技术介绍
神经胶质瘤是来源于神经上皮的肿瘤，是颅内最常见的恶性肿瘤，约占全部颅内肿瘤的40-50%，以发病率高、复发率高、致死率高，成为肿瘤治疗的难题。传统治疗方法主要是手术和放化疗来提高患者的生存机率。但是位于重要功能区的胶质瘤很难做到全切除。放射治疗几乎是各型胶质瘤的常规治疗，但疗效评价不一，除髓母细胞瘤对放疗高度敏感，室管膜瘤中度敏感外，其他类型对放疗均不敏感。化疗药物限于血脑屏障及药物的毒副作用，疗效尚不肯定。近年来，免疫治疗成为脑胶质瘤继手术、放化疗后的有效治疗手段。与其他方式联合应用，具体有很强的互补作用，对患者受损的免疫系统能够起到恢复与重建的独特疗效，从而进一步防止肿瘤的复发和转移。现有技术中通过血清培养法对神经胶质瘤干细胞进行增殖培养后裂解得到神经胶质瘤抗原，由于该抗原只具备胶质瘤干细胞携带的抗原信息，只能杀死神经胶质瘤中的肿瘤样干细胞和少量的肿瘤细胞，而由于血清培养液中存在一定的微生物污染，以及动物源免疫原性，因此通过血清培养法获得的神经胶质瘤干细胞制备的抗原稳定性较差，特异性较弱，因此通过该抗原所获得的神经胶质瘤治疗性疫苗具有稳定性差、特异性较弱、杀瘤率不高以及免疫原性弱等缺陷。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对现有技术中神经胶质瘤抗原所携带的抗原信息有限，通过该抗原所获得的疫苗杀瘤率低、免疫原性较弱等缺陷，提供一种抗原信息较齐全的神经胶质瘤全肿瘤抗原及其制备方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是:一种神经胶质瘤全肿瘤抗原的制备方法，所述制备方法包括以下步骤:获取神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞，将两者混合后进行细胞裂解，即获得神经胶质瘤全肿瘤抗原。在本专利技术提供的神经胶质瘤全肿瘤抗原的制备方法中，神经胶质瘤干细胞与神经胶质瘤非干细胞的个数比例为1:2-2:1。在本专利技术提供的神经胶质瘤全肿瘤抗原的制备方法中，神经胶质瘤干细胞与神经胶质瘤非干细胞的个数比例为1:1。在本专利技术提供的神经胶质瘤全肿瘤抗原的制备方法中，采用反复冻融裂解法或X射线照射法进行细胞裂解。在本专利技术提供的神经胶质瘤全肿瘤抗原的制备方法中，采用反复冻融裂解法进行细胞裂解的条件为:液氮或-80°C冻存和37°C水浴复融，反复冻融3次。 在本专利技术提供的神经胶质瘤全肿瘤抗原的制备方法中，在进行细胞裂解之前，还包括采用无血清培养液对所述神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞进行的增殖培养过程。在本专利技术提供的神经胶质瘤全肿瘤抗原的制备方法中，所述无血清培养液为:含有成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子和B27的培养液。在本专利技术提供的神经胶质瘤全肿瘤抗原的制备方法中，取处于对数生长期的神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞在进行细胞裂解。在本专利技术提供的神经胶质瘤全肿瘤抗原的制备方法中，继细胞裂解之后还包括离心步骤，离心条件为:l_4°C、5000rpm离心10_20min。本专利技术还提供一种神经胶质瘤全肿瘤抗原，由上述神经胶质瘤全肿瘤抗原的制备方法所获得。本专利技术进一步保护上述神经胶质瘤全肿瘤抗原在制备神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗中的应用。实施本专利技术提供的神经胶质瘤全肿瘤抗原及其制备方法，可以达到以下有益效果:采用神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞制备的神经胶质瘤全肿瘤抗原较现有神经胶质瘤抗原携带的抗原信息较多较全，因此采用本专利技术提供的神经胶质瘤全肿瘤抗原所制备的疫苗，不仅能杀死神经胶质瘤干细胞，而且还能够杀死神经胶质瘤肿瘤细胞，杀瘤率较高，且免疫原性较强。【具体实施方式】本专利技术提供的一种神经胶质瘤全肿瘤抗原的制备方法，该方法包括以下步骤:1、分别获取神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞进行增殖培养；2、将步骤1中增殖后的神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞混合后进行细胞裂解；3、对步骤2中裂解后的神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞进行离心，弃上清后，即收获神经胶质瘤全肿瘤抗原。具体地，步骤1中，神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞的获取步骤为:(11)获取神经胶质瘤肿瘤组织块；(12)从步骤(11)中的神经胶质瘤肿瘤组织块中获取神经胶质瘤单细胞并进行增殖培养；(13)从步骤(12)中增殖后的神经胶质瘤单细胞分离出神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞。步骤(11)中，取新鲜的人脑神经胶质瘤组织，在本专利技术中，该神经胶质瘤组织块取自复旦大学附属华山医院神经外科11例胶质瘤患者手术切除的新鲜标本，均经术后病理确诊。然后，将新鲜的人脑胶质瘤组织用含有120mmol.L 'NaC1.Smmol.L 'KCl^Smmol.L 'Glucose (葡萄糖)和20mmol.L 'Pipes (哌嗪-1，4- 二乙磺酸)的缓冲液洗净血污，剪切成1_3大小的胶质瘤组织块备用。步骤(12)中，将步骤(11)中处理的神经胶质瘤肿瘤组织块用DMEM培养液洗涤2-3次，加入5-10倍组织体积的0.2%胶原酶IV，在37°C孵箱中消化lOmin，1000r/min离心5min后重新悬浮细胞，用红细胞裂解液去除红细胞后400目钢网过滤，获得单细胞悬液，将单细胞悬液移入离心管，1000r/min离心后弃上清。用无血清培养液重新悬浮离心后的细胞沉淀，优选地，无血清培养液为含有20ng/yL bFGF(成纤维细胞生长因子)、20ng/μ L EGF(表皮细胞生长因子)以及20% B27的DMEM/F12培养液；计数后按3X 105个/cm2的密度接种于25cm2培养瓶，置5% C0 2孵化箱37°C孵育。待培养瓶长满细胞后收集细胞，离心后加入0.2%胶原酶IV消化约5min，反复吹打，离心后弃上清，悬浮后重新接种，按1:2或1:3的比例传代培养至120天，即可获得处于对数生长期的神经胶质瘤单细胞液。与现有技术采用血清培养法培养单细胞不同的是，在该步骤中，本专利技术采用无血清培养液对单细胞进行增殖培养；由于血清培养液存在一定的微生物污染，以及动物源免疫原性且来源有限等，因此，本专利技术采用无血清培养液培养单细胞，不仅可避免血清培养法所带来的不利因素，为单细胞提供一个较稳定的培养条件，而且更加方便纯化增殖后的单细胞，便于后续的加工处理，使最终获得的神经胶质瘤全肿瘤抗原稳定性和特异性更强。另夕卜，在该步骤中获取处于对数生长期的神经胶质瘤单细胞一方面是为了获得足够多的神经胶质瘤单细胞；另一方面，处于对数生长期的神经胶质瘤单细胞性状较稳定，代谢比较旺盛，因此，获得神经胶质瘤干细胞所携带的抗原信息较多。在步骤(13)中，取步骤(12)中获得的神经胶质瘤单细胞液经0.2%胶原酶IV消化、洗涤、离心后用PBS重新悬浮细胞，并调整细胞浓度为IX 105个/ml，按试剂盒说明书进行⑶133/1-PE标记，经流式细胞仪分选出被标记的细胞即神经胶质瘤干细胞，未被标记的即神经胶质瘤非干细胞，分别收集神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞以待备用。本专利技术中的神经胶质瘤非干细胞是指除神经胶质瘤干细胞以外的神经胶质瘤肿瘤细胞。以上仅为本专利技术提供的一种获取神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞的方法，可以理解的是，通过其他方式获得神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞的方法均适用于本专利技术。步骤2中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种神经胶质瘤全肿瘤抗原的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：获取神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤非干细胞，将两者混合后进行细胞裂解，即获得神经胶质瘤全肿瘤抗原。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，鲁菲，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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