一种肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法技术

本发明专利技术涉及一种肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法，试剂盒包括含有荧光素标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液、包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液，以及含有碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液。本发明专利技术使得能够以更低成本和更高准确度和精密度对肿瘤相关抗原CA125进行定量检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种结合了免疫磁微粒分离技术和化学发光免疫分析技术的肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法。
技术介绍
肿瘤相关抗原CA125 (Carbohydrate Antigen, CA125)是一种与上皮性卵巢癌相关的高分子量糖蛋白。CA125是卵巢上皮癌和子宫内膜癌的标志物，国内外报导其敏感性和特异性分别在85-95%和75-90%之间。浆液性子宫内膜癌、透明细胞癌、输卵管癌及未分化卵巢癌患者的CA125含量，均可明显升高。CA125血清浓度轻微上升还见于I %健康妇女，3% -6%良性卵巢疾患或非肿瘤患者，包括孕期起始3个月、行经期、子宫内膜异位、子宫纤维变性、急性输卵管炎、肝病、胸腹膜和心包感染等。卵巢恶性肿瘤占妇科恶性肿瘤的23%，死亡率为妇科恶性肿瘤之首。妇科恶性肿瘤的组织类型繁多，其中上皮癌在85%以上。早期诊断及合理治疗可改善预后及生存期，早期诊断治疗的五年存活率可达60%，而晚期只有10-30%。目前用于检测肿瘤相关抗原CA125的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。酶联免疫分析法存在灵敏度低，线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。化学发光免疫分析法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其具有上述诸多优点得到了广泛的应用。然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其能够以较低的成本制备得到，且能够实现肿瘤相关抗原CA125准确和高精确地定量测定。本专利技术同时还提供一种肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，该方法工艺稳定，成本低，且所得试剂盒的精密度高。一种肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括第一试剂含荧光素标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液；第二试剂含碱性磷酸酶(ALP)标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液；磁分离剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。优选地，该碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体由碱性磷酸酶与肿瘤相关抗原CA125抗体通过交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(Succinimidyl 4- (N-Maleimidomethyl) Cyclohexane-l-Carbo, SMCC)和 2_ 亚氨基硫烧盐酸盐(2-1minothiolane HCl, 2-1T)连接构成。进一步地，所述磁微粒试剂中，包被有荧光素抗体的磁微粒由荧光素抗体与磁微粒通过偶联剂相化学偶联。进一步地，所述第一试剂中的荧光素标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的浓度为0. 5^1 u g/mL，所述第一试剂的pH为7-9 ;所述第二试剂中的碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的浓度为0. 5^1 u g/mL，所述第二试剂的pH为7_9。本领域技术人员应知晓，本专利技术的试剂盒还可以进一步包括有其它检测所需的试齐U，例如底物溶液。但是诸如底物溶液等其它试剂可以另行购买或配制，因此，虽然试剂盒中可以包括这些试剂，但它们对于本专利技术试剂盒来说并非必不可少。本专利技术采取的又一技术方案是一种上述的肿瘤相关抗原CA125的化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述第一试剂、所述第二试剂以及磁分离剂的步骤，其中所述第二试剂的制备过程如下①将肿瘤相关抗 原CA125抗体加入交联剂2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液中室温静置后，再加入甘氨酸溶液，再次室温静置，收集活化后的肿瘤相关抗原CA125抗体，于疒8°C下保存备用；②将碱性磷酸酶溶液加入交联剂4- (N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液，室温静置，收集活化后的碱性磷酸酶，于疒8°C下保存备用；③将上述步骤①所得活化后的肿瘤相关抗原CA125抗体与步骤②所得活化后的碱性磷酸酶混合，静置反应，使生成碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体，反应结束后，将反应液用Supperdex 200凝胶纯化柱纯化,选择具有适当pH值的缓冲液调整浓度和PH值即得所述第二试剂；其中，所述的肿瘤相关抗原CA125抗体、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%,且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg。优选地，步骤①中，取肿瘤相关抗原CA125抗体，加入交联剂2-1T溶液溶解，室温静置10mirT30min，加入甘氨酸溶液，室温静置2 lOmin，用G-25凝胶纯化柱除盐，收集活化后的肿瘤相关抗原CA125抗体，于2-8°C保存备用。优选地，步骤②中，取浓度大于等于5mg/mL的碱性磷酸酶溶液，加入交联剂SMCC溶液，室温静置2(T40min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，于2_8°C保存备用。优选地，步骤③中，将上述活化的肿瘤相关抗原CA125抗体与活化的碱性磷酸酶按分子摩尔比为I I 2混合，于2-8°C条件下静置12-24h。其中适当pH值的缓冲液可以为例如含有0. 5%牛血清白蛋白、pH8. 0的TRI S缓冲液。进一步地，所述的第一试剂的制备方法如下配制含有荧光素的pH为扩10的缓冲液，然后按照荧光素与肿瘤相关抗原CA125抗体的分子比为2(T200:1的比例，将所述含有荧光素的PH为9 10的缓冲液与肿瘤相关抗原CA125抗体的pH为9 10的缓冲液混合，混匀后，室温静置反应，然后将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去游离的荧光素，得到含有荧光素标记的抗肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液，接着用具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH，即得所述的第一试剂。其中适当pH值的缓冲液可以为例如含有0. 5%牛血清白蛋白、PH8.0的TRIS缓冲液。进一步地，所述磁分离剂的制备方法如下将含有羧基活性基团的磁微粒与荧光素抗体在偶联剂碳二亚胺的存在下，室温反应2 18小时，反应结束，磁分离，去上清，用具有适当PH值的缓冲液调整pH和浓度，即得所述的磁分离剂。其中所述的磁微粒具有超顺磁性，其直径为0. 5^2 u m,每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量不低于0. 4mmol ;所述的荧光素抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，纯度大于等于90wt%，稀释效价大于1:100万。优选地，上述的具有适当pH值的缓冲液为含有0. 5%牛血清白蛋白、pH8. 0的TRIS缓冲液。本专利技术所述的荧光素可以是已知的各种荧光素，常用的有例如异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明等。本专利技术同时还 提供了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括：第一试剂：含荧光素标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液；第二试剂：含碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液；磁分离剂：含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括第一试剂含荧光素标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液；第二试剂含碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液；磁分离剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。2.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于所述碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体由碱性磷酸酶与肿瘤相关抗原 CA125抗体通过交联剂4- (N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和2-亚氨基硫烷盐酸盐连接构成。3.根据权利要求1或2所述的肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于所述第一试剂中的荧光素标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的浓度为O.5^1 μ g/mL，所述第一试剂的pH为7-9 ;所述第二试剂中的碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的浓度为O. 5^1 μ g/mL，所述第二试剂的pH为7_9。4.一种如权利要求3所述的肿瘤相关抗原CA125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述含有荧光素标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液、所述含有碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液以及所述包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液的步骤，其特征在于所述含有碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体的溶液的制备过程如下①将肿瘤相关抗原CA125抗体加入交联剂2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液中室温静置后， 再加入甘氨酸溶液，再次室温静置，收集活化后的肿瘤相关抗原CA125抗体，于2l°C下保存备用；②将碱性磷酸酶溶液加入交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液，室温静置，收集活化后的碱性磷酸酶，于2l°C下保存备用；③将上述步骤①所得活化后的肿瘤相关抗原CA125抗体与步骤②所得活化后的碱性磷酸酶混合，静置反应，使生成碱性磷酸酶标记的肿瘤相关抗原CA125抗体，反应结束后， 将反应液用Supperdex200凝胶纯化柱纯化,选择具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH值即得所述第二试剂；其中，所述的肿瘤相关抗原CA125抗体、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过lOOOu/mg。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤①中，取肿瘤相关抗原CA125 抗体，加入偶联剂2-1T溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：于大为，程晓蕾，赵文姬，
申请(专利权)人：苏州浩欧博生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：