【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，本专利技术还涉及一种采用该胶体金免疫试纸条检测李痘病毒的方法。
技术介绍
李痘病毒(Plumpoxvirus, PPV)是我国颁布的最新检疫性病原物，属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)中的马铃薯Y病毒属(Potyvirus),它是核果类果树危险性最大的病毒之一(Dunez，Sutic, 1988 ;Nemeth，1994)，其自然寄主主要是李属的木本植物，如杏(PrunusarmeniacaL.)、桃(P. persicaL.)和欧洲及日本的李子(P. domesticaL.和P. salicinaLindl.)以及甜楼桃(P. aviumL.)和酸楼 I 桃(P. cerasusL.)等。果树一旦受其侵染，则叶片扭曲褪绿，叶脉黄化，特别是果实变形变小，出现花斑，造成品质下降，未成熟果实大量脱落，使产量严重降低，而且其传播速度快，在短时间内即可能给果树业的发展带来灾难性损失。广东地处我国的南方开放地区，地理环境优越，每年经过广东辖区口岸的进出境种子，花卉，苗木等容易携带病毒的材料约占我国总数量的一半，由于进出境批次多，数量庞大，急需研究出即能保证一定的检测数量，又能够检测速度快，而且灵敏度要高，成本也不太昂贵的检测方法。虽然目前在口岸对果树病毒病检测仍然以酶联免疫吸附法(ELISA)为主，但是ELISA需要专门的仪器设备，而且需要有专业人员才可以进行检测判定，操作繁琐，所需时间也比较长，急需更为简单快速灵敏的检测方法才能更加适合口岸快检快放的要求。目前国外国内，植物病毒的检测方法主要有如下5种一...
【技术保护点】
一种检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于按以下步骤制备：A、从李痘病毒感病材料中提取李痘病毒的RNA；B、用RT?PCR的方法克隆李痘病毒的外壳蛋白基因，然后将其连接到原核表达载体pET29(a)上，得到pET29a?PPV重组载体，以序列测定最终验证阅读框架正确的重组质粒，用以李痘病毒外壳蛋白基因的诱导表达；将pET29a?PPV重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)；C、用亲和柱法回收特异性表达蛋白，再免疫家兔，获得李痘病毒抗血清；D、采用上述抗血清制备出检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条。
【技术特征摘要】
1.一种检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于按以下步骤制备 A、从李痘病毒感病材料中提取李痘病毒的RNA； B、用RT-PCR的方法克隆李痘病毒的外壳蛋白基因，然后将其连接到原核表达载体pET29 (a)上，得到pET29a-PPV重组载体，以序列测定最终验证阅读框架正确的重组质粒，用以李痘病毒外壳蛋白基因的诱导表达；将pET29a-PPV重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)； C、用亲和柱法回收特异性表达蛋白，再免疫家兔，获得李痘病毒抗血清； D、采用上述抗血清制备出检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条。2.根据权利要求1所述的检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于步骤A中从李痘病毒感病材料中提取李痘病毒的RNA具体包括以下步骤 (1)李痘病毒感病材料的幼嫩组织若干，液氮研磨，分装成<IOOmg小份至预冷E. P.管，IOOmg样品加入ImLTriZOL抽提；(2)12000rpm，2-8°C 离心 IOmin ； (3)吸取上清液，转移至新的1.5mLE. P.管中，15_30°C放置5min ； (4)加O. 2mL 氯仿，充分抽提 8min，15_30°C放置 2_3min ；(5)I^OOOrpmJ-SO 离心 15min ； (6)吸取上清液，转移至新的1.5mLE. P.管中，加O. 5mL异丙醇，15_30°C放置IOmin ；(7)I^OOOrpmJ-SO 离心 IOmin ； (8)弃去上清液，得胶体状! 應，加l-1.5mL75%乙醇，涡旋混匀； (9)7500rpm、2_8°C离心5min,弃去上清，留下胶体状RNA ；(10)干燥5-10min ； (11)溶于RNase.free水中，枪头打匀，55_60°C温浴IOmin ； (12)5%Agarose胶检测，测定浓度并调至2_3μ g/μ L，_70°C储存备用。3.根据权利要求1所述的检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于步骤B的具体方法包括 a、RT-PCR扩增目的基因 (1)引物 上游序列=PPV-Fl :5’ -CAGGATCCGCTGACGAAAGAGAAGAC-3’，其中 GGATCC 为 BamHI 酶切位点；下游序列PPV_R1 :5’ -TGAAGCTTCACTCCCCTCACACCGAG-3’，其中 AAGCTT 为 HindIII 酶切位点； (2)扩增参数体系 模板RNAl μ L ·5 μ mol/L上游引物I μ L ·5 μ mol/L下游引物I μ L 扩增酶混合液Iμ L ·2Xbufferl2. 5 μ L RNase-freeddH20 至总体积 25 μ L (3)扩增过程·50 V 30min，94 V 3min，94 V lmin，58 V 30s, 72 V lmin，72 V 10min，4 °C ;其中·94°C lmin,58°C 30s, 72°C lmin,72°C IOmin 循环 35 次； b、基因克隆及序列测序 (1)PCR产物的回收 取扩增产物在I % TBE琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕，切下目的条带，采用PCR产物回收试剂盒回收； (2)重组质粒的构建 采用pGEM-T载体进行TA克隆，构建重组质粒；具体步骤为电泳确定回收产物的纯度和浓度；向PCR管中依次加入约4 μ L回收产物，I μ LpGEM18-T载体，5 μ L连接液，补充ddH20至总体积10 μ L ;16°C下反应过夜； (3)感受态细胞制备 于LB培养基平板上活化DH5 α菌株，并挑取单菌落接种于5mLLB液体培养基中，37°C下摇动培养过夜，形成种子菌液；取此5mL菌液，于IOOmLLB液体培养基，37°C摇动培养2 ·2.5hr,至OD600 = O. 6 O. 8时,吸取1. 5mL菌液于1. 5mL离心管中，冰浴5min, 4°C下4000g离心lOmin，弃上清液，重复吸取菌液一次，沉淀用灭菌滤纸吸尽残液，加入300 μ L冰预冷的100mmol/LCaCl2重悬浮菌体,冰浴30min,4°C下4000g离心IOmin,收集沉淀,加入100 μ L冰预冷的100mmol/LCaCl2重新悬浮细菌沉淀，即为感受态细胞，于4°C冰箱中放置12 24hr备用；或加入70 μ L冰预冷的100mmol/LCaCl2和30 μ L50%甘油于_70°C保存备用； (4)重组质粒的转化及筛选 从-70 0C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻，在超净工作台上，取10 μ L连接产物于100 μ L感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴30min，将离心管置于42°C水浴中热激90sec，迅速将离心管冰浴3 5min ;每管中加入800 μ LLB液体培养基，37°C下摇动培养90min ； 采用抗生素和α -互补法筛选重组质粒取IOOmLLB固体培养基加热融化，待冷却至60°C以下时，加入100 μ LAmp，混匀后分倒4个培养皿；凝固后，每皿取4 μ LIPTG及·40 μ LX-gal混匀后均匀涂布平板；待液体被吸收后取200 μ I转化后的菌液均匀涂于上述LB平板上，正向放置30min待液体被吸收，37°C下倒置培养16 24hr ;挑取直径约为I ·2mm大小的白色菌落于5mLLB液体培养基中37°C下摇动培养12 16hr，标记后取O. 7mL与·O.3mL50% (v/v)的灭菌甘油混匀后，置_80°C下保存备用，其余菌液用于重组质粒抽提及鉴定; (5)重组质粒的抽提 经抗生素及α -互补法筛选得到的待检菌落培养物于4°C冰箱内预冷5 lOmin，采用碱裂解法抽提质粒DNA ;具体步骤如下离心管标号，取含重组质粒的菌体液1. 5mL至离心管中，4°C、12000g、离心lmin，弃上清，重复加菌体液一次，离心后将管倒置于吸水纸上，待流尽余液后加入150 μ L溶液I，剧烈振荡，使菌体悬浮，室温放置5 lOmin，加入250 μ L溶液II，颠倒离心管数次，温和混匀，室温放置5min，加入180 μ L溶液III，盖紧离心管，温和颠倒离心管数次，使沉淀混匀，冰浴6 7min，4°C、...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈定虎，王勇，杨雷亮，刘恭源，刘军，
申请(专利权)人：陈定虎，
类型：发明
国别省市：
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