本发明专利技术涉及生物学检测技术领域，具体涉及一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测检测方法及试剂盒，在膜上固定肾综合征出血热病毒抗原，加入待检血清，待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体和所述固定在膜上的抗原结合，再加入含有鼠抗人IgM单抗的金标工作液，鼠抗人IgM单抗与待检血清中的肾综合征出血热抗体结合，显示出红色，最后加入洗涤液，洗去多余的金标工作液和其他杂质。本发明专利技术本发明专利技术试剂盒具有保质期较长、交叉反应少、显色性能较优等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物学检测
，具体涉及一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检 测方法及试剂盒。
技术介绍
肾综合征出血热(Hemorrhagicfever with renal syndrome,以下简称HFRS),我 国习称流行性出血热(Epidemic hemorrhagic fever, EHF),是由汉坦病毒(Hantavirus, HV)引起的以发热、出血、肾脏损害为主要临床特征的自然疫源传染病，鼠为主要的传染源， 寄生螨类参与传播,主要通过接触宿主动物排泄物经伤口、气溶胶、饮食传播。其临床表现 复杂，预后差。对HFRS的实验室诊断方法主要有常规检查、超声检查、基因检测、病毒分离鉴定 与血清学检测等。目前临床主要依据患者的症状、体征及血、尿常规作诊断，这对一些典型 病人尚可，而一旦遇到不典型的病人，诊断就比较困难，常造成误诊或遗漏，不仅使病人在 经济上蒙受不应有的损失，甚至丧失最佳抢救治疗的时机，导致病人死亡，因此，早期诊断 尤为重要。超声检查HFRS对仪器与技术要求较高。基因检测多采用反转录PCR (RT-PCR) 技术，但由于HFRS病程早期病毒载量较小,故在临床标本的检测方面还不够稳定。病毒分 离鉴定法所需周期较长且需要特殊设备。血清学检测方法是HFRS早期检测的一种主要手段，如酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)、间接免疫突光法(IFA)等，ELISA 检出率 高，敏感度和特异性都较好，但大都需要特殊设备，操作人员需要专门的操作技能，一次测 试从采样到孵育、洗板、显色需要很长的时间，浪费大量人力物力，难以在缺少设备的边远 山区、基层医院、诊所开展。间接免疫荧光法需要荧光显微镜等设备，在基层也受到一定限 制。流行性出血热起病后2 3天血清中可检测出流行性出血热IgM抗体，7 10天 达高峰。而流行性出血热IgG抗体在病后数周出现，可持续多年，因此，IgM抗体阳性可对 该疾病进行早期诊断。目前较为简便快捷的血清学检测主要是采用胶体金斑点渗滤法检 测HFRS-1gM抗体，其原理为液体通过微孔滤膜时，标本中的抗体与膜上的抗原相接触并 结合，再加入金标记的抗人抗体显色，达到快速检测的目的(一般在3 5min左右完成)，同 时洗涤液的渗入在短时间内即可达到洗涤目的，成为“床边检验”主要方法之一。该方法以 操作简单便捷、检测速度快、节省人力物力为特点，使得临床检验甚至可以在床边进行，不 需任何仪器、设备及复杂的样本处理过程，结果立即可取，真正做到了床边检验(Point of Care Test，P0CT)，减轻了操作人员的劳动强度。但目前胶体金斑点渗滤试剂的金标液保存 期较短，容易受外界温度等因素影响而发生沉淀等现象，某些诊断试剂盒的保存缓冲液出 于商业原因等并未给出具体组分，给试剂盒的开发应用带来不便。另外，由于试剂盒洗涤液 或样本方面的原因，例如溶血、高血脂、高胆红素等，本底会发红，影响结果判读，尤其是对 于弱阳性标本检测结果的判读。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种适用于临床辅助诊断和鉴别的肾综合征出血热病毒IgM抗体检测方法及试剂盒，以解决现有技术存在的金标液保存期较短，容易受外界温度等因素影响而发生沉淀现象等问题。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是一种肾综合征出血热病毒IgM抗体的检测方法，在膜上固定肾综合征出血热病毒抗原，加入待检血清，待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体和所述固定在膜上的抗原结合，再加入含有鼠抗人IgM单抗的金标工作液，鼠抗人IgM单抗与待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体结合，显示出红色，最后加入洗涤液，洗去多余的金标工作液和其他杂质；所述金标工作液采用如下方法制得⑴制备金标浓缩液取O. 5 1%的氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾，加入O. 4 O. 8被％柠檬酸三钠溶液O. 8 1ml，混匀，待溶液颜色由淡黄至蓝色至紫色至完全透明的酒红色，继续煮沸5 15分钟，停止加热，冷却至室温，向得到的溶液中加入lmg/ml的鼠抗人 IgM单抗O. 2 O. 5ml，然后将混合溶液进行离心处理，弃去上清液，得到下层金标浓缩液；⑵制备稀释液将121.1 242. 2mg的三羟甲基氨基甲烷、O.1 O. 2mg的氯化钠和O. 5 O. 7mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至IOOmL,再加入O. 04 (λ 07wt%诊断试剂防腐剂PR0CLIN300，然后依次加入I 2wt%海藻糖、2ml甘油、O. 03 O. 05wt%黄原胶与O. 8 2. 0wt%的羧甲基壳聚糖，再加入 O. 5ml水杨酸异辛酯一并混匀，最后用盐酸将其pH调节至7. O 7. 5，得到所述稀释液；⑶将所述金标浓缩液与稀释液按1: 15 30的体积比混合，得到金标工作液；所述洗涤液，包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠和牛血清白蛋白，并采用如下方法制得将121.1mg 242. 2mg的三轻甲基氨基甲烧、O.1mg Img的氯化钠和O.1mg Img的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至IOOmL,加入 O.1 O. 2wt%的EDTA，然后再加入体积比为1. 5 2. 0%的丙醇，混匀后加入O. 8 1. 5wt% 的二氯醋酸及O. 2 O. 4wt%的TritonX-100，最后再用氢氧化钠溶液将其pH调节为8. 5 9.0，得到洗涤液。优选的，所述包被膜为硝酸纤维素膜。优选的，所述稀释液和洗涤液瓶置于2 8°C下保存。优选的，所述金标工作液由所述金标浓缩液与稀释液按1:20的体积比混合得到。一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测试剂盒，包括检测盒、按照权利要求1所述方法制备的金标工作液和洗涤液，所述检测盒内设有包被膜，`所述包被膜上设有检测点和质控点，所述检测点包被有固相肾综合征出血热抗原，所述质控点包被有羊抗鼠抗体。优选的，所述肾综合征出血热抗原包被量为O. 2mg/ml的肾综合征出血热抗原 O. 5 μ I,所述羊抗鼠抗体包被量为2mg/ml的羊抗鼠抗体O. 5 μ I。优选的，所述包被膜为硝酸纤维素膜。优选的，所述检测盒放置在湿度小于40%的环境下干燥2小时后，放置在铝箔袋内封口保存。采用上述技术方案后，本专利技术的有益效果是(I)由于改善了金标工作液配方，通过添加糖类与甘油组合物，减少了温度等环境变化对金标溶液体系稳定性的影响，同时由于紫外线吸收剂水杨酸异辛酯的加入，避免了过度光照引起的金标物聚集，从而延长了金标液以及整个试剂盒的保质期，试验证明此专利技术所述金标工作液可稳定16个月之久；(2)通过添加对于血红素助溶及洗涤作用的物质，减少或消除了因标本(例如溶血标本、高胆红素标本)或试剂原因出现的底色发红的现象，提高了检测的灵敏度，尤其是避免了对弱阳性样本的漏检。本专利技术试剂盒具有保质期较长、交叉反应少、显色性能较优的特点，使用方法简单便捷、检测速度快，临床检验不需任何仪器，避免了实验过程中各种因素对结果的影响以及减轻了操作人员的劳动强度；可满足医院诊所及卫生检疫部门的临床需求，也可用于大专院校和科研机构的疾病诊断研究。具体实本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测方法，在膜上固定肾综合征出血热病毒抗原，加入待检血清，待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体和所述固定在膜上的抗原结合，再加入含有鼠抗人IgM单抗的金标工作液，鼠抗人IgM单抗与待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体结合，显示出红色，最后加入洗涤液，洗去多余的金标工作液和其他杂质，其特征在于：所述金标工作液采用如下方法制得：⑴制备金标浓缩液：取0.5～1wt%的氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾，加入0.4～0.8wt%柠檬酸三钠溶液0.8～1ml，混匀，待溶液颜色由淡黄至蓝色至紫色至完全透明的酒红色，继续煮沸5～15分钟，停止加热，冷却至室温，向得到的溶液中加入1mg/ml的鼠抗人IgM单抗0.2～0.5ml，然后将混合溶液进行离心处理，弃去上清液，得到下层金标浓缩液；⑵制备稀释液：将121.1～242.2mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1～0.2mg的氯化钠和0.5～0.7mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，再加入0.04～0.07wt%诊断试剂防腐剂PROCLIN300，然后依次加入1～2wt%海藻糖、2ml甘油、0.03～0.05wt%黄原胶与0.8～2.0wt%的羧甲基壳聚糖，再加入0.5ml水杨酸异辛酯一并混匀，最后用盐酸将其pH调节至7.0～7.5，得到所述稀释液；⑶将所述金标浓缩液与稀释液按1：15～30的体积比混合，得到金标工作液；所述洗涤液，包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠和牛血清白蛋白，并采用如下方法制得：将121.1mg～242.2mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1mg～1mg的氯化钠和0.1mg～1mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，加入0.1～0.2wt%的EDTA，然后再加入体积比为1.5～2.0%的丙醇，混匀后加入0.8～1.5wt%的二氯醋酸及0.2～0.4wt%的TritonX?100，最后再用氢氧化钠溶液将其pH调节为8.5～9.0，得到洗涤液。...
【技术特征摘要】
1.一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测方法，在膜上固定肾综合征出血热病毒抗原，加入待检血清，待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体和所述固定在膜上的抗原结合，再加入含有鼠抗人IgM单抗的金标工作液，鼠抗人IgM单抗与待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体结合，显示出红色，最后加入洗涤液，洗去多余的金标工作液和其他杂质，其特征在于 所述金标工作液采用如下方法制得 ⑴制备金标浓缩液取0. 5 lwt%的氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾，加入0. 4 0.8被％柠檬酸三钠溶液0. 8 1ml，混匀，待溶液颜色由淡黄至蓝色至紫色至完全透明的酒红色，继续煮沸5 15分钟，停止加热，冷却至室温，向得到的溶液中加入lmg/ml的鼠抗人IgM单抗0. 2 0. 5ml，然后将混合溶液进行离心处理，弃去上清液，得到下层金标浓缩液； ⑵制备稀释液将121.1 242. 2mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1 0. 2mg的氯化钠和0.5 0. 7mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至IOOmL,再加入0. 04 0. 07wt9Uf断试剂防腐剂PR0CLIN300，然后依次加入I 2wt%海藻糖、2ml甘油、0. 03 0. 05wt%黄原胶与0. 8 2. 0wt%的羧甲基壳聚糖，再加入0. 5ml水杨酸异辛酯一并混匀，最后用盐酸将其PH调节至7. 0 7. 5，得到所述稀释液； ⑶将所述金标浓缩液与稀释液按1: 15 30的体积比混合，得到金标工作液； 所述洗涤液，包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠和牛血清白蛋白，并采用如下方法制得将121.1mg 242. 2mg的三轻甲基氨基甲烧、0....
【专利技术属性】
技术研发人员：杨致亭，杨金红，王秀利，武新清，孙洪芝，刘迎军，袁忠群，王德亚，
申请(专利权)人：潍坊市康华生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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