一种血管内皮生长因子检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及免疫检测领域，具体涉及一种血管内皮生长因子检测试剂盒，包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液、VEGF参考品、VEGF质控品、VEGF标记物、浓缩洗涤液和发光底物液；其中VEGF标记物通过吖啶酯修饰物对改造的VEGF抗体进行标记。本发明专利技术的检测试剂盒具有检测结果准确、稳定性好、灵敏度高、线性范围宽的优点。

A test kit for vascular endothelial growth factor and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种血管内皮生长因子检测试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及免疫检测领域，具体涉及一种血管内皮生长因子检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
VEGF是Ferrara等(1989)从牛垂体滤泡细胞分离出的可特异性促进血管内皮细胞生长的蛋白质，其作为血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，在体内外均可特异性的促进血管内皮细胞的生长和诱导血管生成。VEGF是一个分子量为45KD的高度糖基化的碱性蛋白，是一种有高度特异性的促进血管内皮细胞分裂，诱导血管新生的因子，它可以特异地作用于血管内皮细胞，促进血管生成，维持血管的正常状态和完整性，提高血管通透性。血管内皮细胞生长因子参与许多病理和生理的表达，在参与骨折愈合的表达全过程中起到重要因素，在糖尿病肾病的发病过程中会表达增强，另外在对白血病和严重肢体缺血的表达中可作为一种基因治疗的药物。研究发现，VEGF在许多病理生理过程中都有表达，例如创伤修复中的血管内皮细胞和巨噬细胞、糖尿病视网膜病变细胞、心脑血管病和肝脏疾病等，并以自分泌、旁分泌和胞内分泌的方式特异地作用于血管内皮细胞膜上的VEGF受体从而引发细胞内信号转导而实现的。在众多血管生成因子当中，VEGF是公认的主要的诱导血管生成的物质，它能强烈地促进血管内皮有丝分裂和新生血管形成。因此目前在诊断疾病时通过对VEGF的检测作为一种良好的诊断手段。现有VEGF诊断试剂盒使用的多为上一代检测技术，信号放大基数不够，而VEGF在人血清中的含量很少，正常人血清中含量为10-80pg/mL，即使是肿瘤中期病人，血清中VEGF含量也只有400-1000pg/mL。现有的试剂盒灵敏度不高，在实际应用中一旦检测到VEGF的含量，基本上标示该例病人为肿瘤晚期患者，无法起到早期诊查的目的；而且在对样本检测时还存在漏检的情况，此外现有的VEGF试剂稳定性较差。因此针对上述问题有必要开发一种血管内皮生长因子的检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种血管内皮生长因子的检测试剂盒，该试剂盒检测结果准确、稳定性好、灵敏度高、线性范围宽。为了实现上述专利技术的目的，本专利技术的技术方案是：一种血管内皮生长因子检测试剂盒，所述检测试剂盒包括包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液、VEGF参考品、VEGF质控品、VEGF标记物、浓缩洗涤液和发光底物液；其中所述VEGF标记物通过吖啶酯修饰物对改造的VEGF抗体进行标记。作为一种改进的技术方案，所述吖啶酯修饰物为吖啶酯DEMS-NHS,所述改造的VEGF抗体是指将VEGF抗体与双功能螯合剂反应制备而成。作为一种改进的技术方案，所述包被VEGF抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:50-1:100的比例配制；所述VEGF标记物的浓度按照其与标记物稀释液1:500-1:10000的比例稀释；所述VEGF参考品和所述VEGF质控品均由VEGF标准品与参考品稀释液配制而成，所述VEGF参考品的浓度范围为0-2500pg/mL；所述VEGF质控品的浓度为125pg/mL、1000pg/mL。作为一种进一步优选的技术方案，所述包被VEGF抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:50的比例配制，所述VEGF标记物的浓度按照其与标记物稀释液1:2000的比例稀释。作为一种优选的技术方案，所述参考品稀释液为pH7.5的HEPES缓冲液，且每1L缓冲液中还含有18-22g酪蛋白钠盐、14-15gSDS、3.8-4gDTT和0.3-0.5mL的PC300。所述浓缩洗涤液按照每1LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中含有7-10gNaCl、0.3-0.6ml吐温-80和6-8mlProclin-300进行配制。作为一种优选的技术方案，所述发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B,所述发光底物液A的pH为2.5-2.6，所述发光底物液A的成分为双氧水和硝酸；所述发光底物液B的pH为12.3-12.7，所述发光底物液B的成分为氢氧化钾和TritonX-100。本专利技术的第二个目的在于：提供一种血管内皮生长因子的检测试剂盒的制备方法。为了实现上述专利技术的目的，本专利技术的技术方案是：一种血管内皮生长因子的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)制备VEGF磁性微球混悬液取磁珠母液，加入磁珠包被缓冲液I混匀，吸取液体后再加入磁珠包被缓冲液I混匀，加入VEGF抗体混匀后再加入磁珠包被缓冲液II，混匀经过一段时间的反应，反应结束后吸取液体，再加入磁珠包被缓冲液III混匀，反应结束后吸取液体，再加入磁珠保存液混匀，再加入磁珠包被缓冲液IV，混匀后得到VEGF磁性微球混悬液；(2)制备VEGF参考品及质控品用参考品稀释液将VEGF标准品按一定的比例稀释成系列参考品，其参考品浓度范围为0pg/mL-2000pg/mL；按照上述操作制备浓度为125pg/mL、1000pg/mL的质控品，分装、冻干；(3)VEGF标记物的制备①溶液配制用0.1M，pH7.5的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸溶液作为缓冲体系，配制浓度为1mg/mLVEGF抗体工作液；②蛋白交联反应取2ml，1mg/mLVEGF抗体工作液，加入300μL，体积浓度为25％戊二醛，经过反应得到蛋白复合物VEGF-GA,再将该蛋白复合物置于HBS缓冲液中透析8h，备用；③吖啶酯标记取0.1mg/mL的吖啶酯DMAE-NHS溶液，按照体积比1:1的比例加入1mg/mL透析后的VEGF-GA溶液，搅拌混匀经过反应得到的VEGF-GA-DMAE反应标记物经过透析，备用；④VEGF-GA-DMAE标记物配置将透析后的VEGF-GA-DMAE反应标记物与标记物稀释液按照体积比1：1000-5000的比例进行配置；(4)配制浓缩洗涤液按照每1L、0.1MHEPES缓冲体系中含有7-10gNaCl、0.5-2gKCl、0.3-0.6mlTritonX-100、6-8mlProclin-300和0.5-1gNaN3进行配置；(5)配制发光底物液A和发光底物液B发光底物液A：取10-20L纯水，再加入200-278.4mlHNO3，100-132.8mlH2O2，纯水定容至30-40L，调pH到2.55±0.5；发光底物液B：取10-20L纯水，再加入300-400gKOH和600-800mlTritonX-100，纯水定容至30-40L，调pH到12.50±0.2；(6)将上述步骤(1)-(5)制备的磁性微球混悬液、VEGF标记物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B分别进行分装。作为一种改进的技术方案，所述磁微粒为粒径1-3μm，且表面包裹有羧基或磺酰基活性基团的磁性微球，VEGF磁性微球混悬液制备时按照按照每50mg磁性微球的用量对1.0-2.5mg的VEGF抗体进行包被。作为一种优选的技术方案，所述步骤(3)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血管内皮生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液、VEGF参考品、VEGF质控品、VEGF标记物、浓缩洗涤液和发光底物液；其中所述VEGF标记物通过吖啶酯修饰物对改造的VEGF抗体进行标记。/n

【技术特征摘要】
1.一种血管内皮生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液、VEGF参考品、VEGF质控品、VEGF标记物、浓缩洗涤液和发光底物液；其中所述VEGF标记物通过吖啶酯修饰物对改造的VEGF抗体进行标记。


2.根据权利要求1所述的一种血管内皮生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述吖啶酯修饰物为吖啶酯DEMS-NHS,所述改造的VEGF抗体是指将VEGF抗体与双功能螯合剂反应制备而成。


3.根据权利要求1所述的一种血管内皮生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述包被VEGF抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:50-1:100的比例配制；
所述VEGF标记物的浓度按照其与标记物稀释液1:500-1:10000的比例稀释；
所述VEGF参考品和所述VEGF质控品均由VEGF标准品与参考品稀释液配制而成，所述VEGF参考品的浓度范围为0-2500pg/mL；
所述VEGF质控品的浓度为125pg/mL、1000pg/mL。


4.根据权利要求1所述的一种血管内皮生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述包被VEGF抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:50的比例配制，所述VEGF标记物的浓度按照其与标记物稀释液1:2000的比例稀释。


5.根据权利要求1所述的一种血管内皮生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述参考品稀释液为pH7.5的HEPES缓冲液，且每1L缓冲液中还含有18-22g酪蛋白钠盐、14-15gSDS、3.8-4gDTT和0.3-0.5mL的PC300。
所述浓缩洗涤液按照每1LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中含有7-10gNaCl、0.3-0.6ml吐温-80和6-8mlProclin-300进行配制。


6.根据权利要求1所述的一种血管内皮生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B,所述发光底物液A的pH为2.5-2.6，所述发光底物液A的成分为双氧水和硝酸；
所述发光底物液B的pH为12.3-12.7，所述发光底物液B的成分为氢氧化钾和TritonX-100。


7.一种如权利要求1所述的一种血管内皮生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备VEGF磁性微球混悬液
取磁珠母液，加入磁珠包被缓冲液I混匀，吸取液体后再加入磁珠包被缓冲液I混匀，加入VEGF抗体混匀后再加入磁珠包被缓冲液II，混匀经过一段时间的反应，反应结束后吸取液体，再加入磁珠包被缓冲液III混匀，反应结束后吸取液体，再加入磁珠保存液混匀，再加入磁珠包被缓冲液IV，混匀后得到VEGF磁性微球混悬液；
(2)制备VEGF参考品及质控品
用参考品稀释液将VEGF标准品按一定的比例稀释成系列参考品，其参考品浓度范围为0pg/mL-2500pg/mL；按照上述操作制备浓度为125pg/...

【专利技术属性】
技术研发人员：田永帅，杨致亭，李建花，高永峰，兰文军，
申请(专利权)人：潍坊市康华生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37