本发明专利技术涉及抗体工程领域，公开了一种新型抗人血管内皮生长因子（huVEGF）的单克隆抗体。具体的，本发明专利技术提供了重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。该单克隆抗体具有与人VEGF特异结合的特性。本发明专利技术还提供了编码该抗体的DNA分子及该抗体的制备方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗体工程领域，具体涉及一种识别人血管内皮生长因子（huVEGF)表位 的鼠单克隆抗体，更具体的，设计该单克隆抗体的重链和轻链可变区的三个高变区氨基酸 序列。
技术介绍
1971年Folkman首先观察到当肿瘤体积超过l-2mm3,需要新血管的形成来维持生 长，从而最早提出肿瘤生长是血管依赖性的，并指出抗血管生成是控制肿瘤生长的新途径。 已有研究表明，几乎所有实体瘤的生长和转移都依赖于肿瘤新血管的生成。 1989 年 Ferrara N 发现了血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)，后来被证明是目前发现的最重要的血管形成因子之一，在肿瘤的血管生长 中发挥着重要作用。对肿瘤的浸润和转移有重要影响，在肿瘤的血管发生过程中发挥极其 重要的作用。VEGF既可以用于肿瘤治疗的理想靶点，也可以作为进行肿瘤诊断和判断预后 的标志物。 VEGF是相对分子质量34000-42000的高度糖基化碱性同源二聚体糖蛋白，其编码 基因位于染色体的6q21. 3,全长14kb，含有8个外显子和7个内含子，可形成9种异构体， 主要包括VEGF121、VEGF 165、VEGF189和VEGF2tl6。其中多数组织以表达VEGF165为主。 Genetech公司针对VEGF的人源化单克隆抗体阿瓦斯丁自2004年上市以来被证明 对于转移性直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等肿瘤均有显著的抑制效果。2006年，其优化后 的抗体片段雷珠被美国FDA批准用于治疗老年黄斑变形，成为治疗老年性黄斑病变、糖尿 病引起的眼底病的首选药。 由于VEGF及其受体的多样性，不同抗原表位或者不同亲和力的VEGF抗体可能有 不同的肿瘤生长抑制效果。因此研究不同的VEGF抗体将有助于VEGF抗体药物的升级。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗人血管内皮生长因子（huVEGF)的单克隆抗体，能够特 异性的识别huVEGF，对huVEGF有很高的亲和力。 本专利技术提供了一种针对huVEGF的鼠源单克隆抗体。 本专利技术还提供了优选的VEGF抗体重链可变区，其中高变区具有下列氨基酸序列： CDRHl (SEQ ID N0.1:SYGVH)，CDRH2 (SEQ ID N0.2:VIWAGGNTNYNSALMS)，CDRH3 (SEQ ID NO. 3 ：GLTTGAffFAF)〇 本专利技术还提供了优选的VEGF抗体轻链可变区，其中高变区具有下列氨基酸序列： CDRL1(SEQ ID N0.4:RSSQSIVHSTGNTYLE)，CDRL2(SEQ ID N0.5:KVSNRFS)，CDRL3(SEQ ID NO. 6 ：FQGSHVPPT)〇 toon] 本专利技术所述单克隆抗体可以是，例如，单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗 体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物或同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域 的任何多肽。【附图说明】 图1为显示间接ELISA法测定单克隆抗体16-3的相对亲和力的图谱； 图2为显示16-3对VEGF与其受体VEGFRl结合的阻抗作用的图谱； 图3为显示16-3对VEGF与其受体VEGFR2结合的阻抗作用的图谱。【具体实施方式】 为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例对 本专利技术作进一步的详细说明。需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本 专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。 实施例1小鼠单克隆抗体的制备和筛选 (1)小鼠的免疫 将VEGF165蛋白溶解在IX PBS，取适量的蛋白溶液与弗氏完全佐剂（Sigma)混匀乳 化，取8周龄的BALB/c雌鼠，皮下多点注射抗原。2周后，取适量的蛋自溶液与弗氏不完全 佐剂（Sigma)混匀乳化，在小鼠的皮下，进行第二次免疫。以后每隔3周，进行第三、四次免 疫。第四次免疫后3天，取脾脏进行细胞融合。 (2)细胞融合 从免疫小鼠内收获脾细胞，将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞分别与该脾细胞悬 液按1:10-100比例混合，加入聚乙二醇使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴 加培养液，以HAT选择性培养基进行细胞培养。 (3)阳性克隆的筛选 待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培 养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体 的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫 组织化学原位测定，选高效价、高特异性的细胞株，命名为16-3。 (4)单克隆抗体可变区序列的获得 利用Trizol (Invitrogen)法提取杂交瘤细胞株16-3的总RNA,然后用oligo-dT 引物和 Superscript II Reverse Transcriptase(Invitrogen)反转录成 cDNA。经 PCR 扩增 获得抗体重链和轻链的DNA片段，连于克隆载体，挑取克隆进行测序。 (5)单克隆抗体的纯化 单抗16-3采用Hi-Trap protein A HP (GE Healthcare)亲和层析柱从杂交瘤细 胞上清中纯化，SDS-PAGE电泳证明所得产物纯度大于90%。纯化后的16-3直接用于以下实 验。 实施例2小鼠单克隆抗体特性测定 (1)单克隆抗体免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定 取 16-3 杂交瘤细胞株培养上清，采用 Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit (Pierce公司）利用ELISA法测定抗体重链、轻链类型。经鉴定，16-3亚型为IgGl/kappa。 (2)间接ELISA法测定单克隆抗体的相对亲和力 用0. 5 μ g/ml的人VEGF标准品包被酶标版，每孔100 μ 1。37°C温育2小时，用含 l%Tween-20的PBS洗涤后，封闭2小时。将单抗16-3以起始浓度为1 μ g/ml做三倍稀释， 以商品化单抗avastin作为比对，37°C温育1小时。5次洗涤后，分别加入100 μ I HRP标记 的相应二抗，37°C温育1小时。5次洗涤后，加入50 μ 1显色液，37°C温育15分钟，50 μ 12Μ 硫酸终止反应，OD45c!读数。 经过四参数拟合后，16-3的EC50为0· 2Μ。 表1 :间接ELISA法测定单克隆抗体16-3的相对亲和力【主权项】1. 一种抗VEGF的单克隆抗体，其特征在于，它具有含有如下氨基酸序列的三个高变区 的重链可变区：CDRH1 (SEQ ID NO. I :SYGVH)，CDRH2 (SEQ ID N0.2 :VIWAGGNTNYNSALMS)， CDRH3 (SEQ ID N0.3:GLTTGAWFAF)。2. 根据权利要求1所述的抗VEGF单克隆抗体，其特征在于，它还/或具有含有如下氨 基酸序列的三个高变区的轻链可变区：CDRLl (SEQ ID NO. 4:RSSQSIVHSTGNTYLE)，CDRL2 (SEQ ID NO. 5 :KVSNRFS)，CDRL3 (SEQ ID NO. 6 :FQGSHVPPT)。3. 根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗VEGF的单克隆抗体，其特征在于，它具有含有如下氨基酸序列的三个高变区的重链可变区：CDRH1（SEQ ID NO.1：SYGVH），CDRH2（SEQ ID NO.2：VIWAGGNTNYNSALMS），CDRH3（SEQ ID NO.3：GLTTGAWFAF）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张发明，席甘，黄莺，
申请(专利权)人：中美华世通生物医药科技武汉有限公司，张发明，席甘，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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