本发明专利技术涉及抗体工程领域，公开了一种新型抗人血管内皮生长因子（huVEGF）的单克隆抗体。具体的，本发明专利技术提供了重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。该单克隆抗体具有与人VEGF特异结合的特性。本发明专利技术还提供了编码该抗体的DNA分子及该抗体的制备方法。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及抗体工程领域，公开了一种新型抗人血管内皮生长因子（huVEGF）的单克隆抗体。具体的，本专利技术提供了重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。该单克隆抗体具有与人VEGF特异结合的特性。本专利技术还提供了编码该抗体的DNA分子及该抗体的制备方法。【专利说明】一种抗血管内皮生长因子的单克隆抗体
本专利技术属于抗体工程领域，具体涉及一种识别人血管内皮生长因子（huVEGF)表位 的鼠单克隆抗体，更具体的，设计该单克隆抗体的重链和轻链可变区的三个高变区氨基酸 序列。
技术介绍
1971年Folkman首先观察到当肿瘤体积超过1-2 mm3,需要新血管的形成来维持生 长，从而最早提出肿瘤生长是血管依赖性的，并指出抗血管生成是控制肿瘤生长的新途径。 已有研究表明，几乎所有实体瘤的生长和转移都依赖于肿瘤新血管的生成。 1989 年 Ferrara N 发现了血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)，后来被证明是目前发现的最重要的血管形成因子之一，在肿瘤的血管生长 中发挥着重要作用。对肿瘤的浸润和转移有重要影响，在肿瘤的血管发生过程中发挥极其 重要的作用。VEGF既可以用于肿瘤治疗的理想靶点，也可以作为进行肿瘤诊断和判断预后 的标志物。 VEGF是相对分子质量34000-42000的高度糖基化碱性同源二聚体糖蛋白，其编码 基因位于染色体的6q21. 3,全长14 kb,含有8个外显子和7个内含子，可形成9种异构体， 主要包括VEGF121、VEGF165、VEGF 189和VEGF2Q6。其中多数组织以表达VEGF165为主。 Genetech公司针对VEGF的人源化单克隆抗体阿瓦斯丁自2004年上市以来被证 明对于转移性直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等肿瘤均有显著的抑制效果。2006年，其优化 后的抗体片段雷珠被美国FDA批准用于治疗老年黄斑变形，成为治疗老年性黄斑病变、糖 尿病引起的眼底病的首选药。 由于VEGF及其受体的多样性，不同抗原表位或者不同亲和力的VEGF抗体可能有 不同的肿瘤生长抑制效果。因此研究不同的VEGF抗体将有助于VEGF抗体药物的升级。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗人血管内皮生长因子（huVEGF)的单克隆抗体，能够特 异性的识别huVEGF，对huVEGF有很高的亲和力。 本专利技术提供了一种针对huVEGF的鼠源单克隆抗体。 本专利技术还提供了优选的VEGF抗体重链可变区，其中高变区具有下列氨基酸序 列： CDRH1 (SEQ ID N0.1:TYGMS)，CDRH2 (SEQ ID N0.2:ISNGGSYTFYPDSVKG)，CDRH3 (SEQ ID NO. 3 :HGSVTTRGFDY)。 本专利技术还提供了优选的VEGF抗体轻链可变区，其中高变区具有下列氨基酸序 列： CDRL1 (SEQ ID N0.4:KASQSVSNDW)，CDRL2 (SEQ ID N0.5:YASNRYT)，CDRL3 (SEQ ID NO. 6 ：LQDYSSPFT)〇 toon] 本专利技术所述单克隆抗体可以是，例如，单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗 体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物或同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域 的任何多肽。 【具体实施方式】 为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例对 本专利技术作进一步的详细说明。 实施例1小鼠单克隆抗体的制备和筛选 1)小鼠的免疫 将VEGF165蛋白溶解在1XPBS，取适量的蛋白溶液与弗氏完全佐剂（Sigma)混匀乳 化，取8周龄的BALB/c雌鼠，皮下多点注射抗原。2周后，取适量的蛋自溶液与弗氏不完 全佐剂（Sigma)混匀乳化，在小鼠的皮下，进行第二次免疫。以后每隔3周，进行第三、四 次免疫。第四次免疫后3天，取脾脏进行细胞融合。 2)细胞融合 从免疫小鼠内收获脾细胞，将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞分别与该脾细胞悬液按 1 :10-100比例混合，加入聚乙二醇使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加 培养液，以HAT选择性培养基进行细胞培养。 3)阳性克隆的筛选 待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上 清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分 泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织 化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株，命名为16-5。 4)单克隆抗体可变区序列的获得 利用Trizol(Invitrogen)法提取杂交瘤细胞株16-5的总RNA，然后用oligo-dT引物 和 Superscript II Reverse Transcriptase (lnvitrogen)反转录成 cDNA。经 PCR 扩增获 得抗体重链和轻链的DNA片段，连于克隆载体，挑取克隆进行测序。 序列表 〈110>中美华世通生物医药科技（武汉）有限公司 <120> 一种抗血管内皮生长因子的单克隆抗体 <130> 1 <160> 10 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT 〈213>重裢可变区CDR1 <400> 1 Thr Tyr Gly Met Ser 1 5 〈210〉 2 〈211〉 17 〈212〉 PRT 〈213〉重裢可变区CDR2 〈400> 2 Thr lie Ser Asn Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val Lys 15 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT 〈213>重裢可变区CDR3 〈400> 3 His Gly Ser Val Thr Thr Arg Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 〈210〉 4 〈211〉 11 〈212〉 PRT 〈213〉轻裢可变区CDR1 〈400〉 4 Lys Ala Ser Gin Ser Val Ser Asn Asp Val Val 1 5 10 〈210〉 5 〈211〉 7 〈212〉 PRT 〈213〉轻裢可变区CDR2 〈400> 5 Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 〈210〉 6 〈211〉 9 〈212〉 PRT 〈213〉轻裢可变区CDR3 〈400> 6 Leu Gin Asp Tyr Ser Ser Pro Phe Thr 1 5 〈210〉 7 〈211〉 228 〈212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 7 Leu Glu Val Lys Leu Met Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗VEGF的单克隆抗体，其特征在于：它具有含有如下氨基酸序列的三个高变区的重链可变区：CDRH1（SEQ ID NO.1：TYGMS），CDRH2（SEQ ID NO.2：ISNGGSYTFYPDSVKG），CDRH3（SEQ ID NO.3：HGSVTTRGFDY）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张发明，席甘，
申请(专利权)人：中美华世通生物医药科技武汉有限公司，张发明，席甘，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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