一种缓释生长因子多细胞球培养膜板及其构建方法技术

本发明专利技术提供了缓释生长因子多细胞球培养膜板，是聚酸酐包载由海藻酸钠保护的成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子所得到的，所述海藻酸钠具有网状结构，成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子嵌在该网状结构的孔隙中，是利用聚酸酐对生物体具有良好的生物相容性，特别是聚酸酐降解过程具有表面溶蚀性，首次以具有表面溶蚀性能的聚酸酐为模板材料，包载经海藻酸钠保护的细胞生长因子，利用乳化、溶剂挥发技术制备出具有凹槽空间(孔径5μm‑100μm)、而且缓慢释放细胞因子的三维多细胞球培养膜板。

【技术实现步骤摘要】
一种缓释生长因子多细胞球培养膜板及其构建方法
本专利技术涉及生物医学领域，尤其是一种缓释生长因子多细胞球培养膜板及其构建方法。
技术介绍
肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。急性肝衰蝎是临床亟待解决的治疗难题。尽管内科综合治疗措施取得了较大进展，患者病死率依然高达50％-80％。肝移植可以显著降低病死率，但因供体短缺，大多数患者在等待供肝的过程中死亡。因此生物人工肝与肝细胞移植等细胞水平的新治疗方法得到了研究与发展，在大量动物实验和一些临床实验中获得良好效果，成为有前途的肝病治疗途径。实际上无论是肝细胞移植还是生物人工肝支持治疗，其核心原材料都是肝细胞，对肝功能衰竭患者的治疗作用几乎完全依赖于所用肝细胞的生物学功能。人体中的绝大多数细胞生活在三维的环境中，细胞必须通过细胞-细胞以及细胞-细胞外基质之间的相互作用，获得各种生化和机械信号，才能维持其正常的生理活动。大量研究表明，细胞与细胞外基质以及细胞与细胞之间的相互作用对于调控细胞的迁移、增殖和分化有重要的作用。一般使用的二维单层培养的细胞缺乏这样的信号传递，不能很好地模拟体内细胞的微环境。相反，在三维的多细胞球中细胞与外部环境的相互作用可大部分得到重建，因此，和细胞单层相比，多细胞球能更好地模拟体内细胞的微环境。正因为此，多细胞球在基因及功能表达等很多方面更接近于正常人体细胞。通常的细胞培养有贴壁、悬浮两种生长方式。悬浮生长限于少数几类细胞,如白细胞、淋巴组织细胞以及腹水癌细胞等。大部分的细胞如肝细胞为贴壁生长,虽然肝细胞失去接触抑制的特性,但是在普通培养条件下,细胞仍然以二维生长为主。因此，为实现肝细胞的三维生长,创造避免贴壁的生长条件是现阶段亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种缓释生长因子多细胞球培养膜板。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述缓释生长因子多细胞球培养膜板的构建方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种缓释生长因子多细胞球培养膜板，是聚酸酐包载由海藻酸钠保护的成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)所得到的，所述海藻酸钠具有网状结构，成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)嵌在该网状结构的孔隙中。上述缓释生长因子多细胞球培养膜板中所述聚酸酐是一类新型的医用高分子材料，具有生物降解特性。具有(Ⅰ)所示分子结构，据R基的不同，可将聚酸酐分为脂肪族聚酸酐、芳香族聚酸酐、杂环族聚酸酐、聚酰酸酐、聚酰胺酸酐、可交联的酸酐、含磷聚酸酐等。优选的，上述缓释生长因子多细胞球培养膜板，所述聚酸酐为芳香族聚酸酐P(CPP-SA)(聚酸酐〔聚1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸])，具有(Ⅱ)所示分子结构，优选的，上述缓释生长因子多细胞球培养膜板，所述膜板中各成分的用量比按重量份数计为聚酸酐94.8-97.8份、海藻酸钠0.5-2份、成纤维细胞生长因子0.01-0.1份和肝细胞生长因子0.01-0.1份。上述缓释生长因子多细胞球培养膜板的构建方法，具体步骤如下：(1)配置有机相：将聚酸酐〔聚1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸](P(CPP-SA))与表面活性剂双十二烷基二甲基溴化铵(DDDA·Br)以20-40:1-1.5的质量比混合；室温下溶于二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷体积比为1-2:1-5的混合溶液中，至聚酸酐完全溶解，得有机相溶液A备用；(2)配置水相：成纤维细胞生长因子(FGF)溶于0.8％海藻酸钠溶液中配成600ng/mLFGF多糖保护溶液；肝细胞生长因子(HGF)溶于0.8％海藻酸钠溶液中配成600ng/mLHGF多糖保护溶液；按体积比0.1-1:1-0.1将FGF多糖保护溶液和HGF多糖保护溶液进行混合，得水相溶液B备用；(3)有机相溶液A和水相溶液B按体积比20-50：1-2投放，在2℃-6℃水浴中，通风橱内磁力搅拌下缓慢滴加水相溶液B到有机相溶液A中，30min后放入室温下通风橱内磁力搅拌8h,乳化后制得油包水微球乳液；(4)将乳化后制得的油包水微球乳液在室温下，通风橱内环境湿度为50％-70％的条件下浇铸在干净的玻璃皿基底上，待有机溶剂和水完全挥发后，得到有序的凹孔状具有缓释生长因子的多细胞球培养膜板。优选的，上述缓释生长因子多细胞球培养膜板的构建方法，具体步骤如下：(1)配置有机相：将聚酸酐〔聚1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸](P(CPP-SA))与表面活性剂双十二烷基二甲基溴化铵(DDDA·Br)以20:1的质量比混合；室温下溶于二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷体积比为1:3的混合溶液中，至聚酸酐完全溶解，得有机相溶液A备用；(2)配置水相：成纤维细胞生长因子(FGF)溶于0.8％海藻酸钠溶液中配成600ng/mLFGF多糖保护溶液；肝细胞生长因子(HGF)溶于0.8％海藻酸钠溶液中配成600ng/mLHGF多糖保护溶液；按体积比1:1将FGF多糖保护溶液和HGF多糖保护溶液进行混合，得水相溶液B备用；(3)有机相溶液A和水相溶液B按体积比25：2投放，在4℃水浴中，通风橱内磁力搅拌下缓慢滴加水相溶液B到有机相溶液A中，30min后放入室温下通风橱内磁力搅拌8h,乳化后制得油包水微球乳液；(4)将乳化后制得的油包水微球乳液在室温下，通风橱内环境湿度为65％的条件下浇铸在干净的玻璃皿基底上，待有机溶剂和水完全挥发后，得到有序的凹孔状具有缓释生长因子的多细胞球培养膜板。本专利技术的有益效果是：上述缓释生长因子多细胞球培养膜板，利用聚酸酐对生物体具有良好的生物相容性，特别是聚酸酐降解过程具有表面溶蚀性，首次以具有表面溶蚀性能的聚酸酐为模板材料，包载经海藻酸钠保护的细胞生长因子，利用乳化、溶剂挥发技术制备出具有凹槽空间(孔径5μm-100μm)、而且缓慢释放细胞因子的三维多细胞球培养膜板。不同于现有技术中聚酸酐包载生长因子，本专利技术采用聚酸酐制备细胞培养模板，而使用海藻酸钠包载生长因子后制备凹槽，用于细胞培养。通过对多孔膜板制备、影响因素、细胞因子释放、体外细胞毒性试验等研究，证明所述多细胞球培养膜板具有适宜多细胞球立体培养的凹槽空间，可以缓慢释放活性细胞因子，无细胞毒性，可以促进细胞三维增殖培养，为进一步多细胞球立体培养研究奠定了基础。附图说明图1是多细胞球培养膜板结构放大图；图2为缓释生长因子多细胞球培养膜板红外光谱图(IR)；图3是缓释生长因子多细胞球培养膜板扫描电镜图，可以看到在多细胞球培养膜板中存在着有序的周期性结构，形成孔洞比较均一的凹槽状，约为12μm左右，孔洞呈单层排布，孔深约为2.8μm左右，孔洞和玻璃皿基底之间也存在一层较薄的聚酸酐层面；图4是聚酸酐浓度0.2mg/ml扫描电镜；图5是聚酸酐浓度0.8mg/ml扫描电镜；图6是聚酸酐浓度3.2mg/ml扫描电镜；图7是DMF-CH2CL2(1：3)溶剂凹孔状膜板扫描电镜；图8是DMF-CHCL3(1：3)溶剂凹孔状膜板扫描电镜；图9是湿度为20％时凹孔状膜板扫描电镜；图10是湿度为40％时凹孔状膜板扫描电镜；图11是湿度为60％时凹孔状膜板扫描电镜本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种缓释生长因子多细胞球培养膜板，其特征在于：是聚酸酐包载由海藻酸钠保护的成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子所得到的，所述海藻酸钠具有网状结构，成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子嵌在该网状结构的孔隙中。

【技术特征摘要】
1.一种缓释生长因子多细胞球培养膜板，其特征在于：是聚酸酐包载由海藻酸钠保护的成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子所得到的，所述海藻酸钠具有网状结构，成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子嵌在该网状结构的孔隙中。2.根据权利要求1所述的缓释生长因子多细胞球培养膜板，其特征在于：所述聚酸酐为聚酸酐〔聚1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸]。3.根据权利要求1所述的缓释生长因子多细胞球培养膜板，其特征在于：所述膜板中各成分的用量比按重量份数计为聚酸酐94.8-97.8份、海藻酸钠0.5-2份、成纤维细胞生长因子0.01-0.1份和肝细胞生长因子0.01-0.1份。4.权利要求1所述的缓释生长因子多细胞球培养膜板的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)配置有机相：将聚酸酐〔聚1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸]与表面活性剂双十二烷基二甲基溴化铵以20-40:1-1.5的质量比混合；室温下溶于二甲基甲酰胺和二氯甲烷体积比为1-2:1-5的混合溶液中，至聚酸酐完全溶解，得有机相溶液A备用；(2)配置水相：成纤维细胞生长因子溶于0.8％海藻酸钠溶液中配成600ng/mL成纤维细胞生长因子多糖保护溶液；肝细胞生长因子溶于0.8％海藻酸钠溶液中配成600ng/mL肝细胞生长因子多糖保护溶液；按体积比0.1-1:1-0.1将成纤维细胞生长因子多糖保护溶液和肝细胞生长因子多糖保护溶液进行混合，得水相溶液B备用；(3)有机相溶液A和水相溶液B按体积比20-50：1-2投放，在2℃-6℃水浴中，通...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆伟，于美丽，时钢，苏瑞，王勇，刘蕾，代庆海，
申请(专利权)人：天津市第一中心医院，天津市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：天津,12