本发明专利技术属于生物技术领域，涉及以核苷酸定点突变方法对人角质细胞生长因子(KGF-2)一级结构单个氨基酸的置换，即将KGF-2第100位的赖氨酸的编码序列AAG突变为精氨酸编码序列AGG，通过构建原核表达载体pBV220-hKGF-2-K100R获得一种热稳定性的人KGF-2突变体重组蛋白KGF-2-K100R。实验证实，与天然的KGF-2相比，hKGF-2-K100R具有相同的表达量和促细胞增殖的生物活性，但突变体重组蛋白热稳定性明显优于天然的KGF-2。本发明专利技术得到一种新型稳定的KGF-2突变体，在室温条件下长时间保持结构和功能的稳定，便于保存、运输，在医药及化妆品制备方面具有非常广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及通过核苷酸定点突变方法对人角质细胞生长因子(hKGF-幻一级结构单个氨基酸的置换，即将hKGF-2第100位的赖氨酸的编码序列AAG 突变为精氨酸编码序列AGG，然后利用原核表达系统获得一种强稳定性的人KGF-2突变体 hKGF-2-K100R。实验证实，hKGF-2-K100R具有天然hKGF-2的生物活性和明显的室温稳定性。这种新型稳定的hKGF-2突变体，可以在室温条件下长时间保持结构和功能的稳定，便于保存、运输，在生物药业和生物制剂方面具有非常广泛的应用前景。
技术介绍
角质细胞生长因子-2(keratinocyte growth factor-2，KGF-2)亦称成纤维细胞生长因子-10(fibroblastgrowth factors-10，FGF-10)，是FGFs超家族中角质细胞生长因子家族的一员。它是由208个氨基酸残基组成的单链多肽，相对分子质量约为MkD，其 N端含有40个氨基酸残基的信号肽序列。KGF-2具有广泛的生理功能，它是脊椎动物胚胎发育过程中不可替代的调节因子，在组织修复，神经再生，血管生成中具有重要作用；KGF-2 具有显著促有丝分裂作用，是各种来源的组织器官上皮细胞特异性的有丝分裂源；研究发现KGF还与多种肿瘤发生、发展密切相关；KGF-2对烧伤、溃疡、切割伤等的修复和再生具有显著的促进愈合，减少疤痕的产生，因而KGF-2作为一种新型多肽类药物，具有广阔的开发和应用前景。目前利用基因工程技术可以实现KGF-2原核可溶性表达并纯化工艺成熟，这为获得大量的的重组KGF-2提供基础和保证。但重组KGF-2对酸和热不稳定，易降解，半衰期短，储存困难，KGF-2的性质不稳定给用药带来困难。在不改变蛋白的空间结构的基础上通过蛋白一级结构氨基酸序列的改变如氨基酸置换、添加和截短可以获得其稳定性突变体。为了获得hKGF-2热稳定性突变体，本专利技术通过核苷酸定点突将hKGF-2第100位的赖氨酸编码序列AAG突变为精氨酸编码序列AGG，利用基因工程技术获得一种人KGF-2突变体KGF-2-K100R。稳定检测实验发现，hKGF-2突变体具有明显的热稳定性，室温48小时内几乎没有出现明显的降解现象，同时生物活性检测结果突变体与天然的hKGF-2具有相同的生物活性。这种新型稳定的hKGF-2突变体，便于储存和运输，具有极大地应用前景。
技术实现思路
本专利技术是利用原核系统表达和纯化了一种新型人KGF-2突变体，即通过核苷酸定点突将hKGF-2第100位的赖氨酸编码序列AAG突变为精氨酸编码序列AGG，利用原核表达载体通过基因工程技术获得一种突变体蛋白KGF-2-K100R。这种突变体具有天然hKGF-2的生物活性和强的生物稳定性，在室温48小时内没有明显的降解现象。hKGF-2突变体核苷酸序列ATGCAAGCCCTTGGTCAGGACATGGTGTCACCAGAGGCCACCAACTCTTCTTCCTCCTCCTTCTCCTCTCCTTCCAGCGCGGGAAGGCATGTGCGGAGCTACAATCACCTTCAAGGAGATGTCCGCTGGAGAAAGCTATTCTCTTTCACCAAGTACTTTCTCAAGATTGAGAAGAACGGGAAGGTCAGCGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAGGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGAIACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCAT AATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAA(AAG——AGG)hKGF-2突变体氨基酸序列MQALGQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNRKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQH NGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS附图说明图1载体pBV220-hKGF-2_K100R质粒构建图谱。图浊KGF-2-K100R核酸序列重叠PCR扩增1 :hKGF_2突变体前段序列；2 hKGF-2 突变体后段序列；3 :hKGF-2突变体完整序列；M :DL2000。图 3pBV220-hKGF-2 和 pBV220-hKGF-2_K100R 原核表达产物 SDS-PAGE 分析M 低分子量蛋白标准；1 诱导后的pBV220-hKGF-2全菌体；2 诱导前的pBV220_hKGF_2全菌体；3诱导后的pBV220全菌体；4 诱导前的pBV220全菌体；5 诱导前的pBV220-hKGF-2_K100R 全菌体；6 诱导后的pBV220-hKGF-2-K100R全菌体。图4纯化后的rhKGF-2和rhKGF-2-K100R SP SDS-PAGE分析M 低分子量蛋白标准；1 2 :rhKGF-2SP纯化0. 9mmoINaCl洗脱产物；3 :rhKGF_2SP纯化洗脱的杂蛋白；4 rhKGF-2-K100R SP 纯化洗脱的杂蛋白；5 6 :rhKGF-2_K100R SP 纯化0. 9mmolNaCl 洗脱产物。图5rhKGF-2和rhKGF_2_K100R蛋白稳定性差异比较M 低分子量蛋白标准；1 4分别为室温48、36、M、12小时rhKGF-2降解结果；5 8 分别为室温48、36、对、12小时 rhKGF-2-K100R 降解结果。图6rhKGF-2和rhKGF-2-KlOOR对Hep_2细胞增殖活性检测。 具体实施例方式1. pBV220-hKGF-2 和 PBV220-hKGF-2_K100R 表达载体的构建1)根据已报道的人KGF-2基因序列和KGF-2突变体突变位点核苷酸，设计特异性引物，并在连接引物的两端端引入限制性内切酶位点，其中在反向引物中将原终止密码子 TAG改为大肠杆菌偏性的TAA。核酸定点突变原则设计一对重叠PCR引物使KGF-2第100 位的赖氨酸LyslOO (aag)突变为精氨酸ArglOO (agg)。引物 Pl :5' CGGAATTCATGCAAGCCCTTGGTCAGGACAT-3'，含有 EcoRI 位点；P2 :5 ‘-CGGGATCCTATTATGAGTGTACCACCAT-3 ‘，含有 BamHI 位点。定点突变overlapPCR 引物 P3 :5' -CTTAGCCATGAACAGGAAGGGGAAAC-3‘ ；P4 5'-GTTTCCCCTTCCTGTTCATGGCTAAG-3‘。2)利用人胎肝cDNA文库为模板，引物Pl和P2本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邵宁生，孙卫国，刘农乐，王芳，李少华，赵强，李洁，丁红梅，夏伟，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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