一种细胞因子突变体融合抗体的制备及其应用制造技术

本发明专利技术属基因工程抗体技术领域，具体地公开了一种靶向人血管内皮生长因子(VEGFR2，亦称KDR)的抗体JZB00与一种干扰素α(IFNα)突变体的融合抗体JZA02、其制备方法及用途。本发明专利技术还公开了JZA02的重链和轻链免疫球蛋白分子的氨基酸序列。本发明专利技术还提供了JZA02重链及轻链基因的构建方法，转染CHO细胞，有限稀释法挑取单克隆，后通过真核细胞分泌表达、亲和层析纯化获得融合抗体。本发明专利技术的融合抗体可特异性结合于VEGFR2，可以抑制肿瘤新生血管的生成，偶联的突变干扰素部分还可以发挥直接的肿瘤杀伤作用和免疫调节作用，同时不产生毒副作用，从而更好地抑制肿瘤的生长。该融合抗体在体外可以抑制人静脉内皮细胞(HUVEC)及部分肿瘤细胞的增殖，且抑制程度高于野生型IFNα与JZB00的融合抗体JZA01。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞因子突变体融合抗体的制备及其应用本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种可与人VEGFR2特异结合的高亲和力全人源融合抗体，该抗体以JZA01为基础，通过突变干扰素，提高其与干扰素受体IFNAR1和IFNAR2的亲和力，从而发挥更好的抗肿瘤效果。该抗体不仅能抑制人血管内皮生长因子受体2的活化，从而抑制肿瘤新生血管的生成，而且通过靶向作用使IFN富集于肿瘤及肿瘤新生血管部位，且不产生毒副作用；更重要的是，通过对干扰素进行突变，在保证其活性不发生改变的前提下，其与干扰素受体IFNAR1和IFNAR2的亲和力大大提高，发挥更强的肿瘤杀伤作用和免疫调节作用，是一种具有抗血管生成活性和抗肿瘤活性的基因工程抗体。
技术介绍
肿瘤细胞的发生发展离不开新生血管的营养供给，而新生血管的生长离不开各种细胞因子及其受体的相互作用。现有研究表明，血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体(VEGF/VEGFR)信号通路对于新生血管的生成具有关键性的调节作用。VEGFR2作为VEGF的主要受体，调节血管内皮细胞的增殖、存活、迁移和通透性的改变。人血管内皮生长因子受体2(vascularendothelialgrowthfactorreceptor2，也称为VEGFR2或KDR、Flk-1，本文称作“VEGFR2”)是230kDa的跨膜糖蛋白，属于受体酪氨酸激酶超家族，是血管生长因子(VEGF)的主要功能受体，主要分布在血管内皮细胞和淋巴内皮细胞中，VEGF刺激内皮细胞增殖、增加血管通透性和新血管生成的作用主要通过结合和激活VEGFR2来实现，同时VEGFR2在一些肿瘤细胞表面也有表达。靶向VEGFR2药物主要有两类：一类是直接作用于受体细胞内区段以防止信号传导的合成的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，主要包括Sunitinib、Ceritinib等；另一类是阻断配体结合到受体胞外功能域的单克隆抗体(mAb)，包括雷莫卢单抗(Ramucirumab)等。干扰素(interferon，IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，它具有广谱的抗病毒、抗肿瘤活性，同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，是目前主要的抗肿瘤生物制品之一。但是干扰素因半衰期短、系统性毒副作用强等缺点限制了其在临床上的应用。借助基因重组技术将干扰素与靶向VEGFR2的全长抗体偶联，既可以延长干扰素体内半衰期，同时可以借助抗体的靶向作用将干扰素富集于肿瘤及肿瘤新生血管部位，降低其系统毒副作用，令其更有效地发挥抗肿瘤及免疫调节作用。本课题组已经基于该原理表达出这种具有抗血管生成活性和抗肿瘤活性的融合抗体anti-VEGFR2-，即JZA01。虽然野生型干扰素有很强的生物学功能，但由于其与受体亲和力低，它发挥作用受到一定限制。干扰素α的受体有IFNAR1和IFNAR2，它们位于干扰素分子对立的两侧，几乎不相互影响。与IFNAR1的亲和力主要决定抗增殖能力；与IFNAR2的亲和力主要决定抗病毒能力。干扰素与两个受体的联合亲和力，是与IFNAR1和IFNAR2的单独亲和力的乘积；且干扰素与两个受体形成的三聚体复合物的稳定性与介导的抗增殖能力成正比。干扰素与IFNAR1是低亲和力的，提高该亲和力可以明显增强干扰素的抗增殖能力。通过对野生型干扰素进行YNS突变(突变位点：H57Y、E58N、Q61S)，它与IFNAR1的亲和力可以提高60倍，与IFNAR2的亲和力与突变前相当；抗增殖能力可以提高150倍，抗病毒能力提高3.5倍。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术提供一种具有潜在医学和药学价值的全人源抗人VEGFR2的融合抗体。本专利技术蛋白的特征为特异性结合人VEGFR2胞外区，偶联的IFNα突变体其抗病毒、抑增殖及免疫调节功能强于野生型IFNα，在体外能够抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC的增殖及部分肿瘤细胞的增殖，且效果强于JZA01。技术方案一种全人源的抗VEGFR2的融合抗体，其特征在于：以抗VEGFR2的全长抗体JZB00和IFNα突变体蛋白为基础，通过基因重组技术以柔性肽将两者连接。其中一条链由抗VEGFR2的全长抗体的重链与IFNα突变体蛋白以柔性肽连接组成，其氨基酸序列为SEQNO.1；另一条为抗VEGFR2的全长抗体的轻链，其氨基酸序列为SEQNO.2。一种分离的核酸，其特征在于该核酸编码上述的融合抗体。一种表达载体，含有上述的核酸(该遗传资源取自人，自行采集于中国药科大学1518实验室)。一种重组宿主细胞，含上述的表达载体。上述任一项的抗体或抗体片段的应用，选择性地与VEGFR2结合或抑制VEGFR2与VEGFR2配体的结合或中和VEGFR2。上述任一项的抗体片段，选自单链抗体、Fab、单链Fv、双抗体和三抗体。上述任一项的抗体或抗体片段的偶联物。上述任一项的抗体或抗体片段的突变体。靶向VEGFR2融合抗体在肿瘤治疗方面的应用。专利技术进一步说明：本专利技术中全人源抗VEGFR2融合抗体重链由抗VEGFR2的全长抗体的重链与IFNα突变体以柔性肽(GGGGS)连接，轻链为抗VEGFR2的全长抗体的轻链。IFNα经YNS突变后，与IFNAR1的亲和力可以提高60倍，与IFNAR2的亲和力与突变前相当；抗增殖能力可以提高150倍，抗病毒能力提高3.5倍，因此在抗肿瘤及抗病毒方面比IFNα更体现出优势，从而导致JZA02的抗肿瘤及抗病毒效果优于JZA01。含有本专利技术血管内皮生长因子受体2融合抗体基因的表达载体和宿主细胞属于本专利技术的保护范围。扩增本专利技术融合抗体基因的任意片段的引物对也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述抗血管内皮生长因子受体2抗体的方法。WesternBlot鉴定分离纯化得到的JZA02；检测融合抗体加对人静脉内皮细胞HUVEC及部分肿瘤细胞的生长抑制作用。本专利技术得到的抗血管内皮生长因子受体2与人静脉内皮细胞HUVEC表面血管内皮生长因子受体2具有高特异性结合，体外抑制HUVEC及部分肿瘤细胞生长实验结果表明，本专利技术得到的融合抗体可以明显抑制HUVEC及部分肿瘤细胞的生长，且抑制效果强于JZA01。本专利技术为治疗和诊断以血管内皮生长因子受体2抗原的表达，特别是过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法，相关疾病包括但不限于自身免疫病和癌症。附图说明图1是JZA02结构示意图。图2JZA02-Hchain质粒大量提取的核酸凝胶电泳图。图3显示SDS-PAGE蛋白质电泳图，描述发酵表达的JZA01和JZA02分别通过ProteinA亲和层析柱进行分离纯化的结果。Lane1为JZA01，Lane2为JZA02。图4展示利用WesternBlot鉴定纯化后的JZA02。图A、图B分别为用HRP偶联的羊抗人Fc段的抗体检测，得到的JZA01、JZA02、JZA00的非还原(NR)与还原(R)电泳，其中Lane1、2、3、4分别为JZA01、JZA02、JZA02、JZA00。图C、图D分别为用兔抗人κ链的抗体为一抗，HRP偶联的羊抗兔二抗得到的JZA01、JZA02、JZA00的非还原(NR)与还原(R)电泳，其中Lane1、2、3、4分别为JZA01、JZA02、JZA02、JZA00本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全人源的抗人血管内皮生长因子受体2的融合抗体，其特征在于：以抗VEGFR2抗体‑干扰素融合蛋白JZA01(专利申请号为：201610159826.1)为基础，通过突变干扰素，提高其与干扰素受体IFNAR1和IFNAR2的亲和力，从而发挥更好的抗肿瘤作用。

【技术特征摘要】
1.一种全人源的抗人血管内皮生长因子受体2的融合抗体，其特征在于：以抗VEGFR2抗体-干扰素融合蛋白JZA01(专利申请号为：201610159826.1)为基础，通过突变干扰素，提高其与干扰素受体IFNAR1和IFNAR2的亲和力，从而发挥更好的抗肿瘤作用。2.根据权利要求1所述的一种全人源的抗人血管内皮生长因子受体2的融合抗体，其特征在于：其中一条链由抗VEGFR2的全长抗体的重链与IFNα突变体蛋白以柔性肽连接组成，其氨基酸序列为SEQNO.1；另一条链为抗VEGFR2的全长抗体的轻链，其氨基酸序列为SEQNO.2。3.一种分离的核酸，其特征在于，该核酸编码权利要求1的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，朱怡佳，李晨晨，雪莉·莫里森，王旻，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32