本发明专利技术属基因工程抗体技术领域，具体涉及肿瘤血管内皮生长因子受体2(VEGFR2/KDR3)抗体和MICA的融合蛋白的制备方法及用途。本发明专利技术利用基因工程技术将VEGFR2的全长抗体与NK细胞的活化型受体(NKG2D)的配体MHC I类分子相关蛋白A(MICA)通过柔性肽连接并通过CHO细胞进行表达，形成的融合蛋白一方面能够作用于肿瘤细胞表面的VEGFR达到抑制或杀死肿瘤及抑制或破坏肿瘤新生血管的目的，另一方面能够增加肿瘤细胞表面MICA的含量，通过NK细胞表面NKG2D的识别，刺激NK细胞杀伤肿瘤细胞，重建由NKG2D途径激活机体自身的免疫监视作用，并且增强抗体Fc段介导的依赖细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)效应等杀伤肿瘤细胞。
【技术实现步骤摘要】
一种靶向VEGFR2的抗体融合蛋白的制备及其用途
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种可与肿瘤血管内皮生长因子受体(VEGFR/KDR)及NK细胞的活化型受体(NKG2D)特异结合的高亲和力全人源的融合蛋白，能抑制血管内皮生长因子(KDR)受体的活化，可抑制高表达血管内皮生长因子受体人血管内皮细胞HUVEC的生长，并且可增强NK细胞对人乳腺癌细胞的抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，是一种具有靶向VEGFR及NKG2D的抗肿瘤及血管生成活性的高特异性基因工程融合蛋白。
技术介绍
如何在杀死肿瘤细胞的同时不伤害病人是我们一直面临的难题。目前抗肿瘤药物设计的关键是不仅要杀死肿瘤细胞，而且要恢复机体的免疫监视作用，让免疫系统来杀死肿瘤细胞。肿瘤和免疫系统之间的相互作用可以分为：早期免疫介导的肿瘤“清除”、“平衡”和肿瘤的“逃逸”三个阶段。免疫系统免疫监护作用的一个重要的机制就是肿瘤细胞表面MHC-I相关抗原分子A和B(MHCclassI-relatedchainmoleculesAandB，MICA/B)的表达，MICA/B是表达于自然杀伤细胞(Naturalkillercells，NK细胞)的活化型受体NKG2D的配体。NK细胞借MICA/B与NKG2D的相互作用而与肿瘤细胞靠近、结合，从而通过释放细胞因子等诱导肿瘤细胞的溶解，进而杀伤肿瘤细胞。但研究发现血清可溶性MICA(sMIC)水平的显著升高，导致NK细胞功能缺陷，并进一步指出可溶性MICA由肿瘤细胞表面MIC-A的脱落产生，肿瘤细胞逃脱免疫即发生免疫逃逸。据此，有研究者设计可溶性肽和抗MICA的抗体阻止MICA的脱落，可能发展成为一种新的抗肿瘤治疗方法。激活和重建机体肿瘤免疫作用的一种常规的药物是抗体，比如通过阻断CTLA4的抗体已经被批准上市。抗肿瘤抗体除了人们熟知的中和或抑制某种因子诱导的细胞增殖从而抑制肿瘤生长以外，它的免疫效应功能的主要机制是抗体通过其Fc段与NK或巨噬细胞表面的Fc受体(Fcgammareceptor，FcγR)，FcγRIIIa结合，免疫细胞接近结合有抗体的肿瘤细胞，激活免疫细胞以抗体依赖细胞介导的细胞毒性(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC)。抗血管内皮生长因子受体抗体(VEGFR2antibody)人VEGFR2称为KDR(kinaseinserteddomaincontainingreceptor)，是血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)发挥刺激内皮细胞的增殖、迁移，促进新生血管形成的主要受体。肿瘤新生血管的形成是肿瘤向恶性肿瘤转变必不可少的条件。此外，VEGFR-2还在乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、白血病等多种肿瘤细胞中高表达。因此，VEGF或VEGFR2的抑制剂既可以通过抑制新生血管生成，以“饥饿疗法”阻断肿瘤的营养摄取，又可以抑制肿瘤细胞的增殖或者促进凋亡。目前临床上使用的VEGF抗体-贝伐单抗(bevacizumab)是的一株抑制VEGF通路的单抗。FDA于2014年4月批准靶向VEGFR2的抗体Ramucirumab(IMC-1121B)上市，用于治疗化疗失败的胃癌、胃食管连接处腺癌。相对于临床伴有高血压和出血等副反应的贝伐单抗，抗VEGFR2抗体有较好的安全性。肿瘤细胞表面MHC-I相关抗原分子A(MICA)主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)在免疫应答过程中参与抗原识别，与免疫系统密切相关。其中包括了对免疫起重要作用的MIC(MHCclasscainrelatedGene)家族。MIC家族又称PerB11，位于MHCI类区域，具有高度多态性，存在多种等位基因。它包括MICA、MICB、MICC、MICD、MICE、MICF和MICG7个成员，其中只有MICA、MICB具有编码、表达、转录蛋白的功能，其余均为假基因。其中MICA位于HLA-B位点上游约46kb，全长1722bp编码1382bp的转录子。人体中MICA集中表达在肠道上皮中，其他组织如脑、心脏、肺等中都无表达，但MICA能表达在大多数上皮性肿瘤细胞(乳腺癌、肺癌、肾癌及卵巢癌等)中，被认为是一种肿瘤相关性抗原。因此，MIC-A呈阳性表达的肿瘤细胞在机体的免疫机制中难以逃逸，MICA的脱落则使上述肿瘤细胞虽然呈MICA阳性表达，但依然能逃脱免疫监视。且在上述大多MICA呈阳性的上皮性肿瘤细胞(乳腺癌、肺癌、结肠癌等)中均存在血管内皮生长因子受体2(vascularendothelialgrowthfactorreceptor2，VEGFR2)高表达，故VEGFR-2抗体可作为有效的载体连接MIC-A蛋白，激活NKG2D途径，从而恢复NK细胞免疫监视作用。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术提供一种具有潜在医学和药学价值的一种靶向VEGFR2的抗体融合蛋白。本专利技术融合蛋白的特征为特异性结合人KDR的胞外3区及NKG2D，在体外能够抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人血管内皮细胞HUVEC的生长，且能够增强NK细胞对肿瘤细胞的ADCC效应，其诱导产生的ADCC效应优于VEGFR2抗体诱导产生的效应。技术方案一种靶向VEGFR2的抗体融合蛋白，该融合蛋白以全人源的抗VEGFR2的全长抗体和NKG2D的配体MICA为基础，通过基因重组构建成融合蛋白，利用柔性肽将两段蛋白连接起来。其中一条链由VEGFR2全长抗体重链和MICA蛋白组成，其氨基酸序列表为SEQNO.1；另一条链为VEGFR2全长抗体轻链，其氨基酸序列表为SEQNO.2。一种表达纯化法，其用于分离纯化上述的融合蛋白。一种分离的核酸，其特征在于：该核酸编码权利要求1的靶向VEGFR2的抗体融合蛋白。一组表达载体，含有权利要求4所述的核酸。一种重组宿主细胞，含有权利要求5所述的表达载体。上述任一项的蛋白或蛋白片段的应用，其特征在于选择性地与VEGFR2/NKG2D结合或抑制VEGFR2/NKG2D与VEGFR2配体/NKG2D配体的结合阻断其信号的转导。上述任一项的蛋白或蛋白片段的偶联物。靶向VEGFR2的抗体融合蛋白在治疗肿瘤中的应用。专利技术进一步说明：本专利技术中靶向VEGFR2的抗体融合蛋白由两条链组成，其中一条链由全长抗体和MICA蛋白通过柔性肽(GGGGS)连接，另一条是全长抗体的轻链。含有本专利技术VEGFR2抗体/MICA融合蛋白基因的表达载体和宿主细胞株均属于本专利技术的保护范围。本专利技术的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述融合蛋白的方法。本专利技术利用PCR技术将筛选获得的MICA蛋白与本实验室专利单链抗体(专利号：ZL200910264180.3)构建的VEGFR2全长抗体进行克隆重组，构建VEGFR2全长抗体/MICA融合蛋白重组载体，电转入CHO细胞中，将融合蛋白基因整合到染色体上，利用新霉素G418进行筛选高表达融合抗体的稳定细胞株；对稳定细胞株扩大培养，低温离心取上清，将上清过ProteinA柱进行分离纯化；WesternBlot鉴定分离纯化得到的抗体；SPR实验分析抗体与抗原的亲和能力；M本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种靶向VEGFR2的抗体融合蛋白，其特征在于：该抗体以全人源的抗VEGFR2的全长抗体和NKG2D的配体MICA为基础，通过基因重组构建成融合蛋白，利用柔性肽将两段蛋白连接起来。
【技术特征摘要】
1.一种VEGFR2的全长抗体与MICA的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的一条链由VEGFR2全长抗体重链和MICA蛋白组成，其氨基酸序列为SEQNO.1；另一条链为VEGFR2全长抗体轻链，其氨基酸序列为SEQ...
【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，王旻，王佑富，解伟，柳芳，任学艳，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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