本发明专利技术公开了一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质及其制备方法、用途。利用不相容的双质粒系统在大肠杆菌中表达霍乱毒素B亚基，和增强型绿色荧光蛋白、霍乱毒素A亚基、穿膜肽三种蛋白的融合蛋白EGFP-CTA2-TAT，通过PCR扩增得到CTB基因，将该基因片段克隆到载体pET-28a中，获得重组质粒pET-28a-CTB；以野生型CTA2、EGFP、TAT氨基酸序列为模板，在EGFP与CTA2之间插入3个酶切位点和linker，优化获得适宜在大肠杆菌中表达的密码子，将基因片段克隆到载体PET-22b（+）中，获得重组质粒PET-22b-EGFP-CTA2-TAT；利用PET-28a-CTB和PET-22b-EGFP-CTA2-TAT二者不同抗性，将其共转化到大肠杆菌BL21中，在氨苄青霉素和卡那青霉素的双抗性选择压力下，筛选获得工程菌，该工程菌经IPTG诱导表达后，可获得CTB5/EGFP-CTA2-TAT嵌合蛋白。本发明专利技术同时公开了该蛋白质的制备方法及用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多亚基蛋白质及其制备方法、用途，具体涉及，利用双质粒系统直接在大肠杆菌中表达一种脑靶向蛋白质CTB5/EGFP-CTA2-TAT，属于基因工程技术、蛋白质分离纯化技术及医药生物工程技术相关领域；在医学领域中，本专利技术是一种脑靶向蛋白质，能用于脑靶向蛋白质的无创给药。
技术介绍
蛋白质类药物活性高、毒性低、特异性强，已经成为医药产品中的重要组成部分。近年来有不少脑部疾病治疗用蛋白质类药物问世。蛋白质类药物应用于脑部疾病的最大障碍是血脑屏障。如果无法将药物递送到大脑，治疗也只能隔靴搔痒不得其法。使用脑内注射的方法虽然可以使药物绕过血脑屏障，有效地作用于脑部，但其具有创伤性且可能造成感染、出血等并发症，在临床应用中难以广泛开展及被患者接受。因此迄今为止，还没有一个能无创且特效治疗诸如老年痴呆、帕金森病等中枢神经系统疾病的药物。但相关疾病的发病率却在不断上升。寻找一种途径来协助大分子蛋白质药物通过血脑屏障具有广阔的应用前景。 2011年,康奈尔大学的Aaron J.Carman等宣布找到新的直接开启与关闭血脑屏障的方法:利用腺苷受体随时打开血脑屏障用药。这种非选择性开启血脑屏障的方式的安全性引起了极大争议。 血脑屏障由毛细血管的多层膜性结构组成，其严格的选择性开启机制对于生物来讲极为重要，它只允许诸如氨基酸、氧、血糖与水等营养分子通过。蛋白质类药物由血液进入脑组织间液的过程中，穿越毛细血管内皮细胞是关键性的步骤。与其他组织相比，脑毛细血管内皮细胞的胞饮作用很微弱。因此，对脑毛细血管内皮细胞来说，借胞饮作用转运大分子物质的能力非常有限。要想大分子蛋白质穿越血脑屏障，进入脑内，主要靠载体转运的方式，如:(I)将血脑屏障中特异性蛋白的单克隆抗体作为载体，利用受体介导作用进入脑内；或者利用天然受体转运入脑途径，如胰岛素、转铁蛋白等特异性受体天然存在于脑毛细血管内皮细胞膜上，使用能结合这些受体的特异性载体用于药物转运；(2)血脑屏障内皮细胞带有一定的负电荷，使用带正电荷的材料如脂质体或纳米粒作为载体，利用吸附作用可运送药物进入脑内；(3)利用直接能携带蛋白质穿过细胞膜的肽类载体如穿膜肽(TAT)，将蛋白质转运入脑。 目前，利用单克隆抗体等载体实现脑靶向给药依然是突破血脑屏障的主要手段，2012年将有两个老年痴呆治疗性单克隆抗体药物进入III期临床(http://www.nature.com/news/new-year-new-science-1.9730)。为提高入脑效率，降低副作用，越来越多的研究者试图整合多个载体优势，开发更高效更安全的脑靶向递药载体。如在传统的脂质体载体上掺入脑内受体的配体，抗原决定簇的抗体、靶向肽或穿膜肽，用以提高脑靶向性和载药能力。其中穿膜肽(TAT)成为新的研究热点。 1988年，研究者首次发现人类免疫缺陷病毒(HIV)的反式激活蛋白(TAT)能够跨膜导入细胞内，并保持细胞完好无损，称之为穿膜肽(TAT)。近年来发现并合成了大量穿膜肽，皆为富含阳离子短肽。大量研究证实这些短肽与异源蛋白质结合后，可有效携带比其分子质量大100倍的外源性疏水大分子进入细胞。Schwarze等通过腹腔注射穿膜肽与β-半乳糖苷酶组成的融合蛋白，结果发现穿膜肽能携带该蛋白(分子量高达120 kDa)通过血脑屏障到达脑组织，并能保持酶活性。一系列穿膜肽的发现和应用给脑靶向系统的研发注入了新的活力。不过同时也有研究者担心，高穿膜活性的TAT必然伴随有高细胞毒性。研究发现，低剂量下使用TAT并无细胞毒性。Suhorutsenko J等的研究证实体外实验以10 μ M剂量，体内实验以5 mg/kg的剂量使用TAT是安全的。但同时研究也发现，GFP与穿膜肽融合蛋白在血脑屏障完好无损的情况下入脑效率并不高。 将药物分子搭载于各类靶向载体，可以成功穿越血脑屏障，但需克服载体/复合物产生的免疫反应和细胞毒性。理想的脑靶向递药载体应可以在低剂量下，无创伤给药并将药物高效送入脑内，而载体不进入脑部，避免免疫反应和细胞毒性。 病毒即采用这种方式将病毒基因递送入细胞。病毒由衣壳蛋白和内核基因组成，在侵染至靶细胞内后，脱去衣壳蛋白，内核基因进入宿主细胞。此外，病毒侵染也是天然的入脑通路。不过使用基因治疗必须在体内转录翻译为蛋白质发挥药效。基因持续表达的时间不长、疗效不稳定、对移植部位微环境的影响大小不明确以及可能增加癌变的可能性等问题都引起研究者们的普遍担心。同时，载体安全性也备受关注。同样使用AAV作为载体，荷载有肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)抑制剂基因的基因治疗药物就曾在2007年导致患者死亡，造成恐慌。因此，新的脑靶向载体的设计与开发仍十分迫切。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质。 本专利技术的另一目的是提供生产该蛋白质的方法。 本专利技术的再一目的是提供了该蛋白质的给药途径及用途。 为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下:一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质，由一个氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示的EGFP-CTA2-TAT亚基和五个氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的CTB亚基构成；该蛋白质中含有一个EGFP-CTA2-TAT亚基，EGFP氨基酸序列为SEQ ID N0.3，CTA2氨基酸序列为SEQ IDN0.4，TAT氨基酸序列为SEQ ID N0.5 ；一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质的制备方法，包括用化学合成法和PCR法合成CTB和CTA2-EGFP-TAT的编码序列DNA，将这些DNA分步插入不相容表达载体，采用分步转化法将不相容双质粒转化至大肠杆菌BL21中，采用不相容双质粒表达的方法在大肠杆菌BL21中共表达蛋白质，得到6聚体(CTB) 5/EGFP-CTA2-TAT蛋白，具体方法如下:该蛋白质采用基因工程手段，将霍乱毒素A亚基基因A2 (CTA2)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)以及穿膜肽(TAT)融合表达；本专利技术的融合蛋白亚基使用“EGFP-CTA2-TAT”表示，含有CTA2、EGFP和TAT依次串联，CTB是指来源于霍乱毒菌的霍乱毒素的B亚基，将串联蛋白亚基与CTB分别使用不相容质粒共表达于大肠杆菌，得到六聚体蛋白质CTB5/EGFP-CTA2-TAT:(I)基因设计与获得霍乱毒素B亚基基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。该序列是将野生型的CTB的核苷酸序列的信号肽基因序列切去，获得高表达量的的CTB基因。此外以天然的EGFP、CTA2、TAT氨基酸序列为模板，在EGFP与CTA2之间插入3个酶切位点(Nhe 1.EcoR 1、Sac I)和linker (GGGGS)，通过密码子优化获得的新的基因，基因序列如SEQ ID N0:7所示，由北京普尔普乐公司全合成。 (2)基因工程菌的构建采用primer premier5.0专业引物设计软件设计兼并引物如SEQ ID N0:8~9所示，对SEQ ID N0.6进行PCR扩增，通过Nco I和Xho I连入PET_28a载体中，转化至大肠杆菌DH5 α中，进行质粒提取，质粒PCR、菌液PCR、双酶切、测序鉴本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质，其特征在于：由一个氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的EGFP‑CTA2‑TAT亚基和五个氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CTB亚基构成。
【技术特征摘要】
1.一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质，其特征在于:由一个氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示的EGFP-CTA2-TAT亚基和五个氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的CTB亚基构成。2.根据权利要求1所述的具有脑靶向作用的多亚基蛋白质，其特征在于:该蛋白质中含有一个EGFP-CTA2-TAT亚基，EGFP氨基酸序列为SEQ ID N0.3，CTA2氨基酸序列为SEQID N0.4，TAT 氨基酸序列为 SEQ ID N0.5。3.一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质的制备方法，其特征在于:包括用化学合成法和PCR法合成CTB和CTA2-EGFP-TAT的编码序列DNA，将这些DNA分步插入不相容表达载体，采用分步转化法将不相容双质粒转化至大肠杆菌BL21中，采用不相容双质粒表达的方法在大肠杆菌BL21中共表达蛋白质，得到6聚体(CTB)5/EGFP-CTA2-TAT蛋白，具体方法如下: (1)基因设计与获得 霍乱毒素B亚基基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示；该序列是将野生型的CTB的核苷酸序列的信号肽基因序列切去，获得高表达量的的CTB基因；此外以天然的EGFP、CTA2、TAT氨基酸序列为模板，在EGFP与CTA2之间插入3个酶切位点:Nhe 1、EcoR 1、Sac I和linker:GGGGS，通过密码子优化获得的新的基因，基因序列如SEQ ID NO:7所示，由北京普尔普乐公司全合成； (2)基因工程菌的构建 采用primer premier5.0专业引物设计软件设计兼并引物如SEQ ID N0:8~9所示，对SEQ ID N0.6进行PCR扩增，通过Nco I和Xho I连入PET_28a载体中，转化至大肠杆菌DH5 α中，进行质粒提取，质粒PCR、菌液PCR、双酶切、测序鉴定，获得构建重组质粒PET-28a-CTB ； 采用primer premier5.0专业引物设计软件...
【专利技术属性】
技术研发人员：王华倩，周小芬，林卫萍，张焜，王真史，杜志云，郑希，方岩雄，赵肃清，黄宝华，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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