本发明专利技术公开了一种抗体修饰的荧光纳米粒子及其在癌细胞靶向成像中的应用，所述的荧光纳米粒子由以下步骤制得：将两亲性聚合物与式I所示的荧光化合物溶解在水溶性的有机溶剂中，超声作用下加入到水中；往液面吹氮通过挥发除去有机溶剂，形成负载了荧光化合物的纳米粒子；在纳米粒子水溶液中加入抗体、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基硫代琥珀酰亚胺，反应后形成酰胺键，制得具有靶向成像能力的荧光纳米粒子。传统的荧光成像试剂具有聚集诱导猝灭、光稳定性差、细胞毒性高等缺陷，而本发明专利技术所述的荧光纳米粒子具有更好的检测效果、高发光效率、特异性的识别能力、低细胞毒性、良好的生物相容性和高光稳定性等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医用材料领域，具体涉及一种抗体修饰的荧光纳米粒子及在癌细胞靶向成像中的应用。
技术介绍
在癌症治疗中，传统的化疗通常具有很大的副作用，这是由于传统的癌症诊断方法难以在分子水平上对不同的癌症类型进行区分，导致了具有不同癌细胞类型的病人接受低效率的化疗方法。为了提高治疗效率，降低治疗过程的副作用，需要在分子水平上对癌细胞进行诊断。通过识别癌细胞表面的特异性抗原，可有效区分不同的癌细胞。而单克隆抗体可特异性识别并结合到抗原上，例如西妥昔单克隆抗体可有效结合到高表达表皮生长因子受体的多种癌细胞上，包括头颈癌、结肠癌和肺癌等。已有的癌细胞识别技术，如计算机断层扫描成像(CT)、核磁共振成像(MRI)和正电子发射断层成像(PET)等，这些技术具有低分辨率、低放射性危害和高成本等缺陷，而荧光成像具有高分辨率、高灵敏度、低成本、易于操作、可实时监测、无放射性危害等优点。基于荧光纳米粒子具有高亮度和易于修饰等优点，多种荧光材料包括有机小分子染料、量子点、共轭聚合物等，都被制备为荧光纳米粒子成像试剂。然而，这些荧光材料具有聚集诱导猝灭的缺陷，在通过聚集制备纳米粒子时，其荧光会发生明显的自我猝灭。例如，罗丹明类、花菁类和尼罗红等荧光化合物，当其在纳米粒子中的含量超过1％的质量比时，即发生明显的自我猝灭。为了克服聚集诱导猝灭的缺陷，迫切需要发展新型的高亮度荧光纳米粒子，并实现在癌细胞特异性成像和检测中的应用。近年来，聚集诱导发光材料作为新一代荧光材料，在生物医学领域日益获得广泛应用。聚集诱导发光材料具有强抗光漂白能力、高发光效率、大的斯托克位移和低毒性等优点。由于分子内运动受限，聚集诱导发光材料在聚集态具有高发光效率，因此很容易直接制备为高效发光的纳米粒子。由于荧光纳米粒子可以通过修饰抗体，实现对癌细胞表面抗原的高效率识别和染色标记，且具有光稳定性好等优点，因此荧光纳米粒子在癌细胞的荧光成像和检测中具有明显优势。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的首要目的在于提供一种抗体修饰的荧光纳米粒子的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供由上述方法制得的荧光纳米粒子。本专利技术的再一目的在于提供上述的荧光纳米粒子在癌细胞靶向成像中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种抗体修饰的荧光纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：(1)将两亲性聚合物与式I所示的荧光化合物溶解在水溶性的有机溶剂中，然后在超声作用下加入到水中；往液面吹氮通过挥发除去有机溶剂，形成负载了荧光化合物的纳米粒子；(2)在纳米粒子水溶液中加入抗体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，反应后形成酰胺键，制得具有靶向成像能力的荧光纳米粒子。所述的两亲性聚合物为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酸酐、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-炔基或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叠氮中的一种以上，优选二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-2000和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-2000-羧基的混合物。所述的荧光化合物，其结构通式如式I所示：其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9可以全部相同或者部分相同，为氢或烷基；所述的烷基为1-15个碳原子的直链或支链烷基，优选叔丁基；所述的荧光化合物优选t-BuPITBT-TPE，其结构如下式所示：所述的水溶性的有机溶剂优选四氢呋喃。所述的水优选蒸馏水。所述的抗体是指能够识别特定受体的抗体。本专利技术的目的之一是要实现对高表达表皮生长因子受体的多种癌细胞的成像检测，因此，所述的抗体是能够识别表皮生长因子受体的抗体，优选西妥昔单抗(商品名：爱必妥)或尼妥珠单抗。步骤(1)中，两亲性聚合物与式I所示的荧光化合物质量比优选1:1～2:1，由上述方法制得的抗体修饰的荧光纳米粒子可用于癌细胞靶向成像和检测；所述的癌细胞是高表达表皮生长因子受体的癌细胞，优选非小细胞肺癌细胞；非小细胞肺癌细胞约占所有肺癌的80％，与小细胞型肺癌相比，其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。本专利技术中，式I化合物含有聚集诱导发光性质的四苯基乙烯片段，进而在两亲性聚合物的包裹下形成高亮度荧光纳米粒子，随后通过修饰特异性识别表皮生长因子受体的特异单抗，实现对高表达表皮生长因子受体癌细胞的特异性荧光成像和检测。在本专利技术的上下文中，术语“两亲性聚合物”是指在一个大分子中同时对两相都具有亲和性的聚合物，一般指分子结构中同时含有亲水基团和疏水基团的聚合物。术语“聚集诱导发光”或“聚集诱导发光”是指荧光化合物在稀溶液中几乎不发光，但在聚集态或固态发出强荧光的现象。所述表皮生长因子受体(简称为EGFR)是一种跨膜糖蛋白，具有配体诱导的酪氨酸蛋白激酶活性。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：传统的荧光成像试剂具有聚集诱导猝灭、光稳定性差、细胞毒性高等缺陷，而本专利技术所述的荧光纳米粒子具有更好的检测效果、高发光效率、特异性的识别能力、低细胞毒性、良好的生物相容性和高光稳定性等优点。附图说明图1是t-BuPITBT-TPE-C225纳米粒子的吸收发射光谱；(A)t-BuPITBT-TPE-C225纳米粒子在水溶液中的归一化紫外吸收；(B)t-BuPITBT-TPE-C225纳米粒子的荧光发射光谱。图2是t-BuPITBT-TPE-C225纳米粒子的荧光衰变图。图3是t-BuPITBT-TPE纳米粒子的粒径分布图。图4是t-BuPITBT-TPE纳米粒子的透射电镜图。图5是t-BuPITBT-TPE-C225纳米粒子的粒径分布图。图6是t-BuPITBT-TPE-C225纳米粒子的透射电镜图。图7是免疫印迹分析不同非小细胞肺癌细胞的EGFR的表达水平，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶的英文缩写)表达作为内标。图8是t-BuPITBT-TPE-C225纳米粒子对HCC827和H23细胞的荧光染色图；其中，(A)为HCC827细胞的明场图像，(B)为HCC827细胞的荧光图像，(C)为HCC827细胞的叠加图像，(D)为H23细胞的明场图像，(E)为H23细胞的荧光图像，(F)为H23细胞的叠加图像。图9是t-BuPITBT-TPE-C225纳米粒子在不同孵育时间下的流式细胞检测结果；(A)HCC827细胞；(B)H23细胞。图10是不同浓度的t-BuPITBT-TPE-C225纳米粒子对(A)HCC827细胞和(B)H23细胞的毒性测试结果图。图11是t-BuPITBT-TPE-C225纳米粒子在HCC827细胞内的光稳定性实验。图12是针对HCC827细胞在不同温度和时间孵育下的t-BuPITBT-TPE-C225纳米粒子与CellMask Green，LysoTracker Green和Hoechst 33342的共染实验。图13是针对HCC827细胞预先加入C225并孵育1.5小时，随后加入t-BuPITBT-TPE-C225纳米粒子孵育8小时，HCC827细胞内无荧光信号。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1一种抗体修饰的荧光纳米粒子的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗体修饰的荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将两亲性聚合物与式I所示的荧光化合物溶解在水溶性的有机溶剂中，然后在超声作用下加入到水中；往液面吹氮通过挥发除去有机溶剂，形成负载了荧光化合物的纳米粒子；(2)在纳米粒子水溶液中加入抗体、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基硫代琥珀酰亚胺，反应后形成酰胺键，制得具有靶向成像能力的荧光纳米粒子；所述的两亲性聚合物为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑马来酸酐、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑羧基、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑氨基、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑炔基或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑叠氮中的一种以上；所述的荧光化合物，其结构通式如式I所示：其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9全部相同或者部分相同，为氢或烷基；所述的抗体是能够识别表皮生长因子受体的抗体。
【技术特征摘要】
1.一种抗体修饰的荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将两亲性聚合物与式I所示的荧光化合物溶解在水溶性的有机溶剂中，然后在超声作用下加入到水中；往液面吹氮通过挥发除去有机溶剂，形成负载了荧光化合物的纳米粒子；(2)在纳米粒子水溶液中加入抗体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，反应后形成酰胺键，制得具有靶向成像能力的荧光纳米粒子；所述的两亲性聚合物为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酸酐、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-炔基或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叠氮中的一种以上；所述的荧光化合物，其结构通式如式I所示：其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9全部相同或者部分相同，为氢或烷基；所述的抗体是能够识别表皮生长因子受体的抗体。2.根据权利要求1所述的抗体修饰的荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述的两亲性聚合物为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-2000和二硬脂酰...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐本忠，高蒙，赵祖金，秦安军，林耿伟，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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