KL‑6‑Fc融合蛋白及应用制造技术

本发明专利技术公开了KL‑6‑Fc融合蛋白，作为KL‑6竞争性拮抗剂，通过使用配体‑Fc融合蛋白来作用，则该融合蛋白会与体内KL‑6的受体结合，形成受体‑配体‑Fc复合物，该复合物失去了与KL‑6受体结合的能力，降低有效的配体浓度，也起到了阻断配体‑受体结合的作用，从而阻断其介导的细胞内信号转导途径，以达到减轻肺纤维化的目的。实验表明，用KL‑6‑Fc融合蛋白干预博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型，有效降低了大鼠肺纤维化的程度。KL‑6‑Fc融合蛋白纯度较高，性质稳定，半衰期长。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，特别涉及KL-6-Fc融合蛋白及其在制备治疗肺纤维化药物的应用。
技术介绍
肺纤维化是一种进行性致死性疾病，发病率逐年增加，死亡率相当高，平均生存时间2-2.5年。目前其发病机制尚未完全阐明，有效的治疗方法较少。因此，寻找新的有效的治疗方法成为目前肺纤维化研究的重要目的。目前关于肺纤维化的治疗方法有抗炎、免疫抑制、抗纤维化、抗氧化及干细胞移植等。有些方法尚处于临床研究阶段。许多细胞因子如KL-6、TGF-β、SP-A、MMP-7、CCL-8等是与特发性肺纤维化有关联的血清标志物，其中KL-6蛋白是研究较为深入的血清标志物。KL-6属于肺细胞抗原第９族，黏液素MUC1家族，相对分子质量接近2000000的大分子糖蛋白，正常肺组织中，KL-6在Ⅱ型肺泡上皮表达较多，呼吸性细支气管上皮、支气管腺浆液上皮、乳腺管及胰腺中亦有表达，但表达较少。Ⅱ型肺泡上皮受损、受激发、增殖均可使KL-6分泌增加。特发性肺纤维化是遗传因素和致病因素相互作用的结果，遗传易感致病因素可使肺泡上皮和肺泡下基底膜受到破坏，从而使肺泡上皮通过自分泌和旁分泌作用释放KL-6。KL-6为Ⅱ型肺泡表面抗原，是成纤维细胞的趋化因子，对成纤维细胞具有趋化作用，可导致肺纤维变性，其具体的机制可能通过一系列细胞内信号转导途径实现，诱导纤维细胞增殖从而导致肺纤维化。因此阻断KL-6可减轻成纤维细胞向肺组织转移及肺纤维化形成。有研究表明，KL-6在临床上可作为判断特发性肺纤维化病情活动性的指标。KL-6血清水平亦可预测急性恶化期（AE）的发生风险，血清KL-6水平越高发生AE的可能性越大。有研究应用KL-6抗体给小鼠雾化吸入后应用博莱霉素气管内灌注制造肺纤维化模型，结果显示应用KL-6＋博来霉素组小鼠肺组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、KL-6，TGF-β１及肺泡上皮的凋亡数均较单纯应用博来霉素组明显降低提示阻断KL-6可降低中性粒细胞数量，减轻肺组织损伤。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了阻断其介导的细胞内信号转导途径，从而减轻肺纤维化，而提供一种KL-6-Fc融合蛋白。KL-6-Fc融合蛋白基因，它是由KL-6基因和大鼠IgGFc片段基因融合而成；它的碱基序列如SEQIDNO.1所示。KL-6-Fc融合蛋白基因的制备方法，它包括：1）采集肺纤维化患者病变组织，提取总RNA，反转录成cDNA，并以其为模板；用引物：p1：5'ATGACACCGGGCACCCAGTCTCCTT3'p2：5'CAAGTTGGCAGAAGTGGCTGCCACT3'扩增KL-6基因；2）分离大鼠肠系膜淋巴结中的淋巴细胞，提取总RNA，反转录cDNA，并以其为模板，用引物：p3：5'GCCAGAACAACAGCCCCATCTGTCT3'p4：5'TCATTTACCAGGAGAGCGGGACAGG3'扩增Fc基因；3）以步骤1）、2）的扩增产物的混合物，用引物p5：5'AAGGATCCATGACACCGGGCACCCAGTCTCC3'p6：5'TACTCGAGTCATTTACCAGGAGAGCGGGACAGG3'p7：5'cttctgccaacttgGGTGGTTCTTCCgccagaacaacagc3'扩增，获KL-6-Fc融合蛋白基因。KL-6-Fc融合蛋白，它是由碱基序列如SEQIDNO.1所示的基因表达的蛋白。KL-6-Fc融合蛋白在制备治疗肺纤维化药物的应用。本专利技术提供了KL-6-Fc融合蛋白，可作为KL-6竞争性拮抗剂，通过使用配体-Fc融合蛋白来作用，则该融合蛋白会与体内KL-6的受体结合，形成受体-配体-Fc复合物，该复合物失去了与KL-6受体结合的能力，降低有效的配体浓度，也起到了阻断配体-受体结合的作用，从而阻断其介导的细胞内信号转导途径，以达到减轻肺纤维化的目的。实验表明，用KL-6-Fc融合蛋白干预博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型，有效降低了大鼠肺纤维化的程度。KL-6-Fc融合蛋白纯度较高，性质稳定，半衰期长。附图说明图1为Westernblot检测KL-6-Fc（MUC1-IgG）的表达；图2为HE染色（X100）；图3为Masson染色（X100）。具体实施方式实施例1KL-6-Fc融合基因的获得1.KL-6基因的PCR扩增根据Genbank登录的KL-6（MUC1）基因序列（GI:324120948）设计并合成上下游引物，引物序列如下：上游引物（p1）：5'ATGACACCGGGCACCCAGTCTCCTT3'下游引物（p2）：5'CAAGTTGGCAGAAGTGGCTGCCACT3'采集肺纤维化患者病变组织，常规Trizol法提取总RNA，采用商品化反转录试剂盒，按照说明书操作，获得cDNA，并以其为模板，采用p1、p2引物扩增KL-6基因，大小为819bp。2.大鼠IgGFc片段基因的PCR扩增根据Genbank登录的大鼠IgGFc片段基因序列（GI:57602）设计并合成上下游引物，引物序列如下：上游引物（p3）：5'GCCAGAACAACAGCCCCATCTGTCT3'下游引物（p4）：5'TCATTTACCAGGAGAGCGGGACAGG3'采用常规技术分离大鼠肠系膜淋巴结中的淋巴细胞，Trizol法提取总RNA，采用商品化反转录试剂盒，按照说明书操作，获得cDNA，并以其为模板，采用p3、p4引物扩增Fc基因，大小为990bp。3.KL-6-Fc融合基因的获得为了将KL-6与Fc两段基因融合，根据上述两段基因的序列，设计并合成引物，包括两端引物（p5、p6，含BamHI、XhoI酶切位点）和连接引物（p7，含Linker序列），引物序列如下：p5：5'AAGGATCCATGACACCGGGCACCCAGTCTCC3'（BamHI）p6：5'TACTCGAGTCATTTACCAGGAGAGCGGGACAGG3'（XhoI）p7：5'cttctgccaacttgGGTGGTTCTTCCgccagaacaacagc3'（Linker）以上述扩增的KL-6和Fc基因的混合物为模板，PCR体系如下：PCR运行条件：94℃预变性2min；94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃总延伸5min。反应结束后，取2μl产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示成功扩增出KL-6-Fc融合基因。其碱基序列如SEQIDNO.1所示。实施例2KL-6-Fc融合基因真核表达载体的构建分别对实施例1所述获得的KL-6-Fc基因和商品化的真核表达质粒pcDNA3.1进行BamHI/XhoI双酶切，回收目的片段，并采用T4DNA连接酶，按照说明书操作对目的基因进行连接，连接产物采用常规CaCl2法转化大肠杆菌DH5α，经氨苄青霉素筛选阳性重组子，提取质粒，经BamHI/XhoI双酶切鉴定后表明成功构建了重组表达载体pcDNA3.1/KL-6-Fc。实施例3KL-6-Fc融合蛋白的表达及鉴定采用商品化的CHO-K1细胞系（购自ATCC）作为转染细胞。CHO-K1细胞系在含有青链霉素及10%胎牛血清Ham’sF12K培养基中进行传代培养。通过电穿孔方法将pcDNA3.1/KL-6-Fc转染入CHO-K1本文档来自技高网...

【技术保护点】
KL‑6‑Fc融合蛋白基因，它是由KL‑6基因和大鼠IgG Fc片段基因融合而成。

【技术特征摘要】
1.KL-6-Fc融合蛋白基因，它是由KL-6基因和大鼠IgGFc片段基因融合而成。2.根据权利要求1所述的、KL-6-Fc融合蛋白基因，其特征在于：它的碱基序列如SEQIDNO.1所示。3.KL-6-Fc融合蛋白基因的制备方法，它包括：1）采集肺纤维化患者病变组织，提取总RNA，反转录成cDNA，并以其为模板；用引物：p1：5'ATGACACCGGGCACCCAGTCTCCTT3'p2：5'CAAGTTGGCAGAAGTGGCTGCCACT3'扩增KL-6基因；2）分离大鼠肠系膜淋巴结中的淋巴细胞，提取总RNA，反转录cDNA，并以其为模板，用引物：p3：5'GCCAGAACAACAGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨俊玲，任锦，赵凤莲，张庆华，闫冰迪，刘晓秋，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22