UTI融合蛋白制造技术

本发明专利技术提供UTI融合蛋白、用于产生所述融合蛋白的DNA序列，及使用所述融合蛋白的药物组合物及方法。

UTI fusion protein

The present invention provides UTI fusion protein, DNA sequence for producing the fusion protein, and pharmaceutical composition and method using the fusion protein.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及分子生物学、药理学及医学。专利技术背景尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)，还称为乌司他丁、尿抑制素(uristatin/urinastatin/ulistin)、人抑制剂30(HI-30)、明京(mingin)及比库蛋白，为具有约40kD分子量的蛋白酶抑制剂。UTI存在于人尿液及血液(hUTI)中并且具有各种生理活性诸如对于丝氨酸蛋白酶家族，诸如胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胞浆素、组织蛋白酶-G及白细胞弹性蛋白酶的抑制效应。UTI还具有免疫调节效应，且其可下调促炎性细胞因子，诸如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)及白介素(IL-6)的释放。另外，UTI还干扰PDGF-D(PDGF-DD)/PDGF-BBR活性二聚体介导的信号传导途径，此干扰是通过中和该二聚体来实现的。hUTI已经收到上市授权并且一种产品在日本以商标名Miraclid销售并且从人尿液分离。事实上，从人尿液分离的hUTI当前由多个制造商销售以治疗胰腺炎及由休克造成的急性循环衰竭。UTI首先在人体内以被称为AMBP(α1-微球蛋白/比库蛋白前体)的前体蛋白形式产生，其编码于人染色体9上。AMBP的蛋白水解产生含有143个氨基酸的游离UTI。UTI包括已知抑制丝氨酸蛋白酶的两个Kunitz结构域，其由UTI的N及C末端上的非结构化氨基酸侧接。预期两个结构域赋予蛋白酶抑制的不同特异性，这归因于涉及蛋白酶结合的不同氨基酸。通过与其他丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如BPTI、牛胰腺胰蛋白酶抑制剂)类比的方法，可估计用于蛋白酶抑制的两个关键氨基酸包括Met26(Kunitz结构域1)及Arg88(Kunitz结构域2)。关于UTI的不同部分在抑制不同蛋白酶期间的牵涉所知甚少，但是移除Kunitz结构域1已被证明可改变蛋白酶特异性，从而揭示针对因子Xa及血浆激肽释放酶的新抑制活性。全长UTI不展示此两种蛋白酶的抑制(Morishita等人,Thrombosis Research 1994,第73卷(3/4)第193-204页)。UTI还包括两个连接糖，一个糖O连接于Ser10处并且一个糖N连接于Asn45处。UTI在啮齿动物及人中的半衰期为4-30分钟(Fries等人,International Journal of Biochemistry and Cell Biology,2000,第32卷,第125-137页)。UTI融合蛋白应含有氨基酸的优化序列，包括任何UTI结构域的最佳开始及终止点，且可融合至另一种蛋白质以增强性质诸如表达、纯化、半衰期及稳定性。融合配偶体的确切序列需要确定并且可包括可改变融合配偶体的功能性质的连接子、开始/终止点和/或突变的变化。已知自尿液获得的乌司他丁的变体WO199856916、US5792629、US5407915、US5409895、US7019123及US6583108。已经公开乌司他丁的融合蛋白(及其变化形式)的概念US20080181892、US5541288及US20080255025。某些UTI融合蛋白描述于CN 103044554A中。CN 103044554A的融合蛋白涉及Fc结构域中的特异性变体，大概用于避免任何Fc介导药理学作用(ADCC，CDC)。已经意外地发现具有野生型IgG1的UTI-Fc耐受良好并且提供半衰期的显著增加。另外，与CN 103044554A的UTI融合蛋白相比，本专利技术UTI融合蛋白，尤其SEQ ID NO:1，展现更大热稳定性。本专利技术提供UTI融合蛋白、包含该融合蛋白的药物组合物、制备方法及其用途。专利技术概述本专利技术提供包含UTI结构域及融合配偶体的UTI融合蛋白，其中UTI结构域可操作地连接至融合配偶体。本专利技术提供包含UTI结构域及Fc结构域的UTI融合蛋白，其中UTI结构域可操作地连接至Fc结构域。本专利技术还提供如本文描述的分离的UTI融合蛋白。在一些实施方案中，本专利技术提供UTI融合蛋白，其包含包括SEQID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27及29的序列。在一个实施方案中，本专利技术提供包含SEQ ID NO:1的UTI融合蛋白。在一个实施方案中，本专利技术提供包含SEQ ID NO:3的UTI融合蛋白。在一个实施方案中，本专利技术提供包含SEQ ID NO:5的UTI融合蛋白。在一个实施方案中，本专利技术提供包含SEQ ID NO:7的UTI融合蛋白。在一个实施方案中，本专利技术提供包含SEQ ID NO:9的UTI融合蛋白。在一个实施方案中，本专利技术提供包含SEQ ID NO:11的UTI融合蛋白。在一个实施方案中，本专利技术提供包含SEQ ID NO:13的UTI融合蛋白。在一个实施方案中，本专利技术提供包含SEQ ID NO:15的UTI融合蛋白。在一个实施方案中，本专利技术提供包含SEQ ID NO:17的UTI融合蛋白。在一个实施方案中，本专利技术提供包含SEQ ID NO:19的UTI融合蛋白。在一个实施方案中，本专利技术提供包含SEQ ID NO:21的UTI融合蛋白。在一个实施方案中，本专利技术提供包含SEQ ID NO:23的UTI融合蛋白。在一个实施方案中，本专利技术提供包含SEQ ID NO:25的UTI融合蛋白。在一个实施方案中，本专利技术提供包含SEQ ID NO:27的UTI融合蛋白。在一个实施方案中，本专利技术提供包含SEQ ID NO:29的UTI融合蛋白。根据本专利技术的另一实施方案，本专利技术提供编码UTI融合蛋白的核酸序列，所述UTI融合蛋白包括本文所述UTI融合蛋白。此外，本专利技术提供如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28及30所阐述的DNA序列。在一个实施方案中，编码UTI融合蛋白的核酸进一步包括含有核酸可操作地与其连接的控制序列的载体。在另一实施方案中，本专利技术提供包含编码UTI融合蛋白的核酸序列的宿主细胞，如哺乳动物、昆虫、大肠杆菌或酵母细胞，且将宿主细胞保持在融合蛋白分子得以表达的条件下。在另一实施方案中，本专利技术提供包含本文所述的UTI融合蛋白及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。根据本专利技术的另一实施方案，提供治疗UTI相关病症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本文所述的UTI融合蛋白。即，本专利技术提供UTI融合蛋白作为药物的用途，包括制造药物，和本文所述的UTI融合蛋白用于治疗本文所述的UTI相关病症的用途。附图简述图1是UTI结构域结构及糖基化位点。图2是展示不同连接子的两种UTI-Fc构建体。图3是本专利技术的各种UTI-Fc构建体。图4是用于UTI融合构建中的DNA装配策略(SLIC)。图5是UTI及UTI-Fc1、SEQ ID NO:1对于蛋白酶活性(胰蛋白酶)的抑制图6是UTI-Fc1、UFC1、SEQ ID NO:1对于蛋白酶活性(胰凝乳蛋白酶)的抑制。图7是UTI-Fc1、UFC1、SEQ ID NO:1对于蛋白酶活性(多种蛋白酶)的抑制。图8是UTI及UTI-Fc1、UTI-Fc、SEQ ID NO:1对于细胞因子分泌(IL-6)的抑制。图9是UTI融合蛋白的纯化产量。图10是在C3H小鼠中，SEQ ID NO:1对于LPS诱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种UTI融合蛋白，其包含SEQ ID NO:1。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.24 US 61/943,6171.一种UTI融合蛋白，其包含SEQ ID NO:1。2.一种分离的UTI融合蛋白，其包含SEQ ID NO:1。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白为二聚体，其中所述Fc结构域共价缔合。4.一种药物组合物，其包含根据权利要求1、2或3所述的UTI融合蛋白及药学上可接受的赋形剂。5.根据权利要求1、2或3所述的UTI融合蛋白作为药物的用...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·张伯伦，刘强，M·施密特，
申请(专利权)人：武田有限公司，武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：德国;DE