具有因子IX活性的融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及具有因子IX活性的融合蛋白。本发明专利技术涉及包含凝血因子IX(FIX)和转铁蛋白的融合蛋白。本发明专利技术的融合蛋白具有比天然FIX更大的比活性，因此可用于使用FIX的治疗中。

Fusion protein with factor IX activity

The present invention relates to fusion proteins having factor IX activity. The present invention relates to a fusion protein comprising coagulation factors IX (FIX) and transferrin. The fusion proteins of the present invention have greater specific activity than natural FIX and are therefore useful in the use of FIX in the treatment.

【技术实现步骤摘要】
具有因子IX活性的融合蛋白本申请是申请号为201180050731.1的中国专利申请的分案申请，原申请是2011年10月19日提交的PCT国际申请PCT/KR2011/007795于2013年4月19日进入中国国家阶段的申请。
本专利技术涉及具有凝血因子IX(FIX)活性的融合蛋白。更特别地，本专利技术涉及包含FIX和转铁蛋白的融合蛋白(其表现出的比活性为非融合和天然FIX的比活性的两倍)、编码所述融合蛋白的基因、包含所述基因的重组载体以及包含所述重组载体的宿主细胞。
技术介绍
血友病是由X染色体上的遗传性基因突变导致凝血因子缺陷所引起的出血性疾病。凝集是阻止损伤的血管失血的过程，其中损伤的血管壁被含纤维蛋白的凝块覆盖，所述凝块通过与多种凝集因子相关的复杂凝集级联形成。在凝集因子中，在因子VIII(本文称为FVIII)和因子IX(FIX)缺陷时，它们分别与血友病A和B的发病有关。当FIX缺陷或失活的程度使得凝块形成的凝集级联不发生时，则发生血友病B。为了治疗血友病B，根据凝集因子的水平和出血类型施用不同量的FIX。为了用于治疗血友病B，FIX通常可通过两种方法产生：从人血中纯化和基因重组。虽然重组蛋白质可大量生产，但是其活性和稳定性比通过血浆分级得到的蛋白质差。对重组蛋白质已做出了多种尝试(包括随机突变、结构-活性关系比较、PEG化和n-糖基化)以克服所述缺点，但是它们中的大多数不能实现特别的效果。转铁蛋白是运输铁通过血液的血浆蛋白。这种血浆蛋白是血液中的第三大富含蛋白，半衰期为8天，该半衰期相对来说是长的(虽然比白蛋白或免疫球蛋白G(IgG)的半衰期短)，并且转铁蛋白的特征在于受体介导的循环。虽然已有数种采用转铁蛋白作为融合伴侣的融合蛋白，但是在已公开的任何报道中既没有报道将转铁蛋白用于与FIX融合也没有报道其作用。因此，本专利技术人致力于提高FIX的活性和稳定性；并且发现与非融合、天然FIX相比，当与转铁蛋白直接或经接头连接时，FIX的比活性和血液稳定性显著增加，由此实现了本专利技术。专利技术概述因此，本专利技术的一个目的是提供保持天然因子IX之生物活性的融合蛋白。本专利技术的另一个目的是提供编码所述融合蛋白的基因。本专利技术的又一个目的是提供包含所述基因的重组载体。本专利技术的再一个目的是提供包含所述重组载体的宿主细胞。根据其一方面，本专利技术提供了包含人源因子IX(FIX)和人源转铁蛋白的融合蛋白。根据其另一方面，本专利技术提供了编码所述融合蛋白的基因。根据其又一方面，本专利技术提供了包含所述基因的重组载体。根据其再一方面，本专利技术提供了在其中包含所述重组载体的宿主细胞。附图说明通过本专利技术的以下描述并结合附图，本专利技术的以上和其他目的和特征将变得显而易见，所述附图分别示出：图1a：阐明使用重叠PCR构建FIX片段的过程的示意图；图1b：阐明内含子1的结构和构建片段B的过程的示意图；图2：阐明由分别携带编码FIX(KOI)之cDNA和编码转铁蛋白(Tf)之cDNA的载体构建FIX-Tf表达载体的过程的示意图；图3：阐明构建FIX(KOI)-GS1-Tf表达载体的过程的示意图；图4：阐明构建FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-Tf、FIX(KOI)-GS15-Tf、FIX(KOI)-GS7-THR-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS7-FXa-GS7-Tf和FIX(KOI)-GS7-FXIa-GS7-Tf表达载体的过程的示意图；图5：阐明构建FIX(KOI)-GS1-FXa-Tf和FIX(KOI)-GS1-FXIa-Tf表达载体的过程的示意图；图6：阐明构建FIX(KOI)-G6V-白蛋白表达载体的过程的示意图；图7：FIX(KOI)-Tf(不含接头)、FIX(KOI)-GS1-Tf、FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-Tf、FIX(KOI)-GS15-Tf、FIX(KOI)-GS7-THR-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS7-FXa-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS7-FXIa-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS1-FXa-Tf、FIX(KOI)-GS1-FXIa-Tf和FIX(KOI)表达载体的Western印迹；图8a：示出如通过ELISA和显色活性测定所分析的由FIX(KOI)-Tf(不含接头)、FIX(KOI)-GS1-Tf、FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-Tf、FIX(KOI)-GS15-Tf、FIX(KOI)-GS7-THR-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS7-FXa-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS7-FXIa-GS7-Tf、FIX(KOI)-GS1-FXa-Tf、FIX(KOI)-GS1-FXIa-Tf、FIX(KOI)-G6V-白蛋白、FIX(KOI)和pcDNA3.1/hygro表达载体表达之融合蛋白的FIX活性的图；图8b：示出在图8a结果的基础上计算的FIX比活性的图；图8c：示出如通过ELISA和显色活性测定所测量由FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-Tf、FIX(KOI)-GS1-THR-GS1-del-Tf、FIX(KOI)和pcDNA3.1/hygro表达载体表达之融合蛋白的FIX活性的图；和图8d：示出在图8c结果的基础上计算的FIX比活性的图。专利技术详述下文详细描述本专利技术。本专利技术提供了包含因子IX(FIX)和转铁蛋白的融合蛋白。在本专利技术融合蛋白中使用的FIX和转铁蛋白可来源于任何哺乳动物，优选来源于人。更优选地，所述FIX和转铁蛋白与其各自的天然蛋白质有95％或更高的同源性。最优选地，所述FIX和转铁蛋白分别具有SEQIDNO:1和2所示的氨基酸序列。在本专利技术的一个实施方案中，融合蛋白可包含FIX和转铁蛋白的功能等价物或衍生物。“功能等价物”可以在SEQIDNO:1和2的氨基酸序列上具有一个或更多个氨基酸缺失、插入、非保守或保守替换或其组合，只要所述突变不引起负责FIX生物活性之活性部位或结构域的实质改变，则其可在任何序列位置中发生。根据情况，本专利技术的融合蛋白可经历这些修饰以升高或降低其物理和化学性质，例如磷酸化、硫酸化、丙烯酸化(acrylation)、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等。只要它们保持FIX的基本生物活性，则所修饰的融合蛋白在本专利技术的范围内。在本专利技术的融合蛋白中，转铁蛋白的N端可连接至FIX的C端。或者，本专利技术的融合蛋白还可在FIX与转铁蛋白之间包含接头。也就是说，FIX的C端可通过接头连接至转铁蛋白的N端。通过使两种融合伴侣之间的潜在干扰最小，接头可增加融合蛋白的FIX的活性。所述接头优选是长度为1至100个氨基酸的肽，但不限于此长度。只要它将融合蛋白中的FIX与转铁蛋白分隔开，可采用任何肽作为本专利技术的接头。虽然对接头的氨基酸序列没有具体限制，但是其可优选地包含重复或随机模式的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基。例如，所述接头可优选地包含氨基酸序列(GGGGS)N(其中N是1或更大的整数，优选1至20)，更优选SEQIDNO:3或4的氨基酸序列(参见表2)。而且，所述接头可具有可被大量存在于损伤组织中的蛋白酶识别并消化的切割位点。选自凝血酶、因子Xa和因子XIa的蛋白酶可识别消化位点。在作用位点上，包含具有这种蛋白酶消化位点本文档来自技高网...

【技术保护点】
融合蛋白，其包含人源因子IX(FIX)和人源转铁蛋白。

【技术特征摘要】
2010.10.20 KR 10-2010-01025721.融合蛋白，其包含人源因子IX(FIX)和人源转铁蛋白。2.权利要求1的融合蛋白，其中所述FIX是具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽或其功能等价物。3.权利要求2的融合蛋白，其中所述功能等价物具有与FIX基本相同的功能活性，并且在SEQIDNO:1的所述氨基酸序列上具有一个或更多个氨基酸插入、缺失或替换。4.权利要求1的融合蛋白，其中所述转铁蛋白是具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽或其功能等价物。5.权利要求4的融合蛋白，其中所述功能等价物具有与转铁蛋白基本相同的功能活性，并且在SEQIDNO:2的所述氨基酸序列上具有一个或更多个氨基酸插入、缺失或替换。6.权利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白在所述FIX与所述转铁蛋白之间包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：李旼宣，金薰泽，李峰镛，朴万勋，林允挺，
申请(专利权)人：SK化学公司，
类型：发明
国别省市：韩国,KR