本发明专利技术公开了一种用于大豆胰蛋白酶抑制剂活性检测的荧光聚合物及其制备方法和应用，该树脂的结构如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)中，R1独立地选自苯基或者C1～C4烷基；R2独立地选自R3独立地选自代表取代的位置。该聚合物侧链末端带有聚乙二醇单甲醚基团，可以使聚合物在水中溶解，并能在水中被含有苯环与硝基的物质淬灭荧光，并且在低浓度荧光聚合物溶液中，不同浓度的淬灭剂对该物质的荧光淬灭曲线为线性关系，符合Stern-Volmer方程，从而可以由荧光强度的改变实现荧光检测功能。同时，由于聚合物荧光较为强烈，故可实现低浓度下的荧光检测，并可减小对待测体系的影响。
【技术实现步骤摘要】
用于大豆胰蛋白酶抑制剂活性检测的荧光聚合物及其制备方法和应用
本专利技术属于化学分析检测领域，具体涉及一种用于大豆胰蛋白酶抑制剂活性检测的荧光聚合物及其制备方法和应用。
技术介绍
大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)是存在于大豆蛋白质中的一种重要功能性成分，研究证实大豆胰蛋白酶抑制剂具有一定的抗癌活性、治疗糖尿病和抗辐射等多种生理功能,在生物农药、医药等领域均有着广泛的应用前景(程晓明,郭瑞华，“大豆胰蛋白酶抑制剂的分离提纯及降糖活性研究”，《时珍国医国药》,2009,20(4):903-904；孟令秋,吴江,周春亏，“抑肽酶佐治脑出血的临床研究”，《中风与神经病学杂志》，2003,20(3):233-236；金蓓,田少君，“大豆胰蛋白酶抑制剂研究概况”，《粮食与油脂》，2005(6):3-6)。因此，如果能够对大豆胰蛋白酶抑制剂的活性实现快速有效的检测，将具有重要的意义，开发出一种高效的、灵敏的大豆胰蛋白酶抑制剂活性检测新方法将会有广阔的应用前景。传统的胰蛋白酶抑制剂检测方法利用了胰蛋白酶能够催化苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基酰替苯胺盐酸盐(BAPA)分解产生对硝基苯胺的特点，对对硝基苯胺进行紫外吸收测量，当体系中加入胰蛋白酶抑制剂时，胰蛋白酶活性被抑制，生成的对硝基苯胺量会减少。通过对对硝基苯胺含量的紫外吸收在410nm处的变化得出胰蛋白酶被抑制的程度，从而得出胰蛋白酶抑制剂的活性。但当试样中含有紫外干扰时，该方法的适用性将得不到保证。与紫外吸收不同的是,荧光光谱检测法作为一种兼具灵敏度与响应性的检测方法，被越来越广泛地应用在生化检测领域当中。其中，荧光聚合物更是以极高的灵敏度和效率被人们所青睐。具有荧光响应的物质通常能够被含有苯环或硝基的分子淬灭荧光，并且在低浓度荧光聚合物溶液中，不同浓度的淬灭剂对该物质的荧光淬灭曲线为线性关系，符合Stern-Volmer方程，由此我们提出一种基于荧光光谱的检测大豆胰蛋白酶抑制剂活性的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于大豆胰蛋白酶抑制剂活性检测的荧光聚合物及其制备方法和应用，该荧光聚合物用于大豆胰蛋白酶抑制剂活性的检测时，具有更高的灵敏度和效率。一种检测大豆胰蛋白酶抑制剂活性的荧光聚合物，结构如式(Ⅰ)所示：式(Ⅰ)中，R1独立地选自苯基或者C1～C4烷基；R2独立地选自R3独立地选自代表取代的位置；n为40～80的整数，m为16～45的整数。本专利技术所述的荧光聚合物为双取代聚苯乙炔类化合物，其固体和溶液状态能够在紫外光激发下发射出强烈荧光。该聚合物侧链末端带有聚乙二醇单甲醚链，可以使聚合物在水中发生溶解，并能在水中被含有苯环与硝基的物质淬灭荧光，并且在检测所使用浓度下荧光淬灭程度与淬灭剂浓度成较好的线性关系，从而可以由荧光强度的改变实现活性的检测功能。同时，由于聚合物荧光较为强烈，故可实现低浓度下的荧光检测，并可减小对待测体系的影响。作为优选，所述的R1独立地选自苯基。本专利技术还提供了一种所述的荧光聚合物的制备方法，包括：树脂前体与氨基聚乙二醇单甲醚或羟基聚乙二醇单甲醚进行取代反应，反应完全后，经过后处理得到所述的树脂；所述的树脂前体的结构如式(Ⅱ)所示：所述的氨基聚乙二醇单甲醚的结构如式(Ⅲ)所示：所述的羟基聚乙二醇单甲醚的结构如式(Ⅳ)所示：式(Ⅱ)～(Ⅳ)中，R1、m和n的定义如前文所述；R4独立地选自C1～C4烷基或者五氟苯基。本专利技术还提供了一种检测大豆胰蛋白酶抑制剂活性的方法，包括如下步骤：(1)向BAPA溶液中加入所述的荧光聚合物、胰蛋白酶和乙酸溶液，充分反应后得到空白标准溶液，测得其荧光强度Abr；(2)向BAPA溶液中加入所述的荧光聚合物和胰蛋白酶，充分反应后得到标准溶液，测得其荧光强度Ar；(3)向BAPA溶液中依次加入所述的荧光聚合物、胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶和乙酸溶液，充分反应后得到空白样品溶液，测得其荧光强度Abs；(4)向BAPA溶液中依次加入所述的荧光聚合物、胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶，充分反应后得到样品溶液，测得其荧光强度As；(5)根据荧光强度Abr、荧光强度Ar、荧光强度Abs和荧光强度As得到所述胰蛋白酶抑制剂的抑制百分率；(6)根据步骤(5)得到的抑制百分率计算得到所述的检测大豆胰蛋白酶抑制剂活性。作为优选，步骤(1)～(4)中，测定荧光强度时所用的激发波长为430nm。作为优选，步骤(1)～(4)中，反应的pH值为9.5，反应的温度为室温。作为优选，步骤(5)中，所述胰蛋白酶抑制剂的抑制百分率的计算公式如下：其中，i为抑制百分率。作为优选，步骤(6)中，大豆胰蛋白酶抑制剂活性的计算公式如下：其中，TIA为胰蛋白酶抑制剂活性；i为抑制百分率；为m0为胰蛋白酶抑制剂质量；m1为胰蛋白酶质量；f1为胰蛋白酶抑制剂稀释倍数。同现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：(1)使用双取代聚苯乙炔型聚合物作为荧光剂，具有灵敏度高，效率高的特点。(2)利用荧光光谱法检测大豆胰蛋白酶抑制剂活性，可扩展该方法的适用范围。附图说明图1为实施例1得到的荧光聚合物的1HNMR谱图。图2为本专利技术的荧光聚合物在大豆胰蛋白酶抑制剂活性检测中的原理示意图。图3为实施例2得到的各个混合液的荧光光谱。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的描述。实施例1荧光聚合物的制备在500mL双口瓶中加入对溴苯甲酸10.3170g及无水甲醇250mL，在70℃下搅拌回流，同时向体系逐滴加入浓硫酸至固体溶解，反应48h后冷却至室温，旋蒸除去过量的甲醇，使用柱层析法进行分离以除去其他杂质，淋洗液为石油醚和乙酸乙酯。得到化合物1白色固体11.4034g，产率为95.0％。在250mL单口烧瓶中加入化合物11.605g(7.5mmol)及磁子，放入手套箱中抽真空充氮气反复三次，而后在手套箱中称取PdCl2(PPh3)3105mg(0.15mmol)、CuI28.6mg(0.15mmol)和PPh378.7mg(0.30mmol)。将烧瓶从手套箱中取出后向其中加入30mL新蒸四氢呋喃和30mL蒸馏除水后的三乙胺，待各物质分散均匀后，加入苯乙炔1.3mL(11.25mmol)，将反应混合物在50℃下反应48h。过滤除去反应中形成的盐，并用无水乙醚洗涤数次。滤液旋蒸浓缩后得到的粗产物，通过硅胶层析柱分离提纯，淋洗液为石油醚和乙酸乙酯(v/v50:1)。产物化合物2为白色固体，产率为82％。在250mL单口瓶中加入化合物21.502g(6.36mmol)，加入KOH2.140g(38mmol)及磁子，加入50mL四氢呋喃以及50mL甲醇，体系加热回流8h后，倒入强烈搅拌下的500mL浓度为1mol/L的盐酸溶液中，使用二氯甲烷萃取，合并有机相，并用MgSO4干燥。粗产物使用柱层析方法提纯，淋洗液为石油醚与乙酸乙酯(v/v10:1)得到化合物3。产率为90％。在250mL单口瓶中加入化合物31.237g(5.5mmol)，N,N’-二环己基碳二亚胺1.720g(8.3mmol)，4-二甲氨基吡啶0.040g(0.33mmol)，对甲苯磺酸0.063g(0.33mmol)，五氟苯酚1.024g(5.5mmol)，以及100mL新蒸二氯甲烷和磁子。该体系在室温下搅拌反应24h后，过滤本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于大豆胰蛋白酶抑制剂活性检测的荧光聚合物，其特征在于，结构如式(Ⅰ)所示：式(Ⅰ)中，R1独立地选自苯基或者C1～C4烷基；R2独立地选自R3独立地选自代表取代的位置；n为40～80的整数，m为16～45的整数。
【技术特征摘要】
1.一种检测大豆胰蛋白酶抑制剂活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)向BAPA溶液中加入结构如式(Ⅰ)所示的荧光聚合物、胰蛋白酶和乙酸溶液，充分反应后得到空白标准溶液，测得其荧光强度Abr；式(Ⅰ)中，R1独立地选自苯基或者C1～C4烷基；R2独立地选自R3独立地选自代表取代的位置；n为40～80的整数，m为16～45的整数；(2)向BAPA溶液中加入结构如式(Ⅰ)所示的荧光聚合物和胰蛋白酶，充分反应后得到标准溶液，测得其荧光强度Ar；(3)向BAPA溶液中依次加入结构如式(Ⅰ)所示的荧光聚合物、胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶和乙酸溶液，充分反应后得到空白样品溶液，测得其荧光强度Abs；(4)向BAPA溶液中依次加入结构如式(Ⅰ)所示的荧光聚合物、胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶，充分反应后得到样品溶液，测得其荧光强度As；(5)根据荧光强度Abr、荧光强度Ar、荧光强度Abs和荧光强度As得到所述胰蛋白酶抑制剂的抑制百分率；(6)根据步骤(5)得到的抑制百分率计算得到所述的检测大豆胰蛋白酶抑制剂活性。2.根据权利要求1所述的检测大豆胰蛋白酶抑制剂活性的方法，其特征在于，所述的R1独立地选自苯基。3.根据权利要求1或2所述的检测大豆胰蛋白酶抑制剂活性的方法，其特征在于，所述荧光聚合物的制备方法包括：树脂前体与氨基聚乙二醇单甲醚或羟基聚乙二醇...
【专利技术属性】
技术研发人员：牛俊峰，尤玉如，毛建卫，杨瑞琴，朱银邦，杨登登，
申请(专利权)人：浙江科技学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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