一种尿激酶与人尿胰蛋白酶抑制剂的分离方法技术

本发明专利技术公开了一种尿激酶与人尿胰蛋白酶抑制剂的分离方法。该方法包括如下步骤：将含有尿激酶和人尿胰蛋白酶抑制剂的溶液，调节pH；缓慢加入硫酸铵粉末，一边加硫酸铵粉末，一边搅拌直到溶液中出现明显蛋白沉淀；调节pH至9.0±0.6；静置后，离心或者加硅藻土过滤，收集富含尿激酶的沉淀，获得尿激酶；上清继续加入硫酸铵至，一边加硫酸铵粉末，一边搅拌使其溶解；静置后，离心或者加硅藻土过滤，收集富含人尿胰蛋白酶抑制剂沉淀2，获得人尿胰蛋白酶抑制剂。该方法简便可行，周期短，有效保护UK和UTI活性，减少UK降解，提高UK质量，不需要特殊设备，降低设备的投入成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制剂的纯化过程和粗制品的生产
，尤其涉及。
技术介绍
男性尿是人体蛋白一种重要的来源，目前从男性尿液中提取的市场最大的两个药用蛋白产品分别是尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制剂，其具有重要的临床治疗价值，并得到了广泛的应用。尿激酶(Urokinase，简写为UK)，是临床上重要的溶栓药物，广泛用于心脑血管和外周血管等处血栓性疾病的治疗，其主要从人尿中提取。人尿中的UK有高分子量(HUK)与低分子量(LUK)两种形式，由于LUK在临床上容易引起出血等副反应，因此，药典要求尿激酶原料药中HUK需大于90%。·人尿胰蛋白酶抑制剂(Urinary trypsin inhibitor,以下简称为UTI)是一种从人尿中分离纯化的由143个氨基酸组成的糖蛋白，等电点在2左右，分子量65000D，具有抑制多种蛋白酶、糖酶和脂酶等水解酶的活性，从而抑制炎症介质的过度释放，改善微循环和组织灌注。而在机体受到严重损伤时起抑制全身性炎症反应(SIRS)的发生发展、继而阻断多脏器功能障碍(MODS)，保护脏器功能等作用。UK和UTI均具有重要的治疗价值，在疾病的治疗中发挥了重要的作用。两种蛋白质均主要从男性尿液中分离制备，生产方式都是先收集尿液，再将尿液运至相应场所进行集中处理，先用硅胶吸附UK，再用壳聚糖吸附UTI ;其后再利用高pH或者或高盐等将这些蛋白从吸附剂上释放出来，利用硫酸铵沉淀等方法得到含有相应蛋白的粗品，粗品再到下游的纯化精制工厂进行进一步的分离纯化，得到相应的原料药产品。UK和UTI粗品是中国非常重要的生化产品。在生产过程中，经常发生UK和UTI混在一起的情况，由于UK是一种丝氨酸蛋白酶，而UTI是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，两者会相互影响，对产品含量的测定以及后续纯化带来严重影响。给生产者带来很大的损失。出现上述情况，目前尚无简便方法进行二者的快速有效分离。有人尝试重新溶解，再用硅胶等吸附剂加工等办法来回收UK和UTI，但周期长，活性损失很大，达到30%以上，尤其是对UK，发生明显的降解，LUK大幅度增加，导致产品的质量严重下降。
技术实现思路
专利技术目的:本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简便可行，周期短，有效保护UK和UTI活性，减少UK降解，提高UK质量的尿激酶与人尿胰蛋白酶抑制剂的分离方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案为:，包括如下步骤:I)将含有尿激酶和人尿胰蛋白酶抑制剂的溶液，调节pH至9.0 ±0.6 ;2)缓慢加入16 — 30% (w/v)硫酸铵粉末，一边加硫酸铵粉末，一边搅拌使其溶解，直到溶液中出现明显蛋白沉淀；3)调节 pH 至 9.0±0.6 ;4)静置I 一 6小时后，离心或者加硅藻土过滤，收集富含尿激酶的沉淀1，获得尿激酶；5)上清继续加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为55% (w/v)以上，一边加硫酸铵粉末，一边搅拌使其溶解；6)静置I 一 6小时后，离心或者加硅藻土过滤，收集富含人尿胰蛋白酶抑制剂沉淀2，获得人尿胰蛋白酶抑制剂。步骤I和步骤3中调节pH使用氢氧化钠溶液或氨水溶液。步骤2中，在溶液中出现明显蛋白沉淀后,再补加1-5% (w/v)硫酸按粉末，并溶解。所述的硫酸铵粉末也可以 采用相当量的硫酸铵溶液替代。本专利技术与现有技术相比，其有益效果是:1、本专利技术的方法收率很高，尿激酶90%以上的活性保留在沉淀I中，而人尿胰蛋白酶抑制剂90%以上的活性保留在沉淀2中；2、两者实现了很好的分离，沉淀I中UTI活性低于3%，沉淀2中未能检测到UK活性；3、该方法整个过程时间短，操作很简单，成本低，不需要特殊设备，降低设备的投入成本；4、不会引起HUK的明显降解，且明显提高了 HUK的比活。具体实施例方式下面通过最佳实施例，对本专利技术技术方案进行详细说明，但是本专利技术的保护范围不局限于所述实施例。实施例1将10克UK粗制品(3.15万U/g)和10克UTI粗制品(2.33万U/g)混合，加IOOml的去离子水，搅拌溶解，离心收集上清液92ml，上清液用IN的NaOH溶液调节pH至8.4 ;缓慢加入16% (w/v)硫酸铵粉末,一边加硫酸铵粉末,一边搅拌使其溶解,溶液中出现明显蛋白沉淀，再补加4.6g硫酸铵粉末，搅拌溶解后，用IN的NaOH溶液调节pH至8.4，静置2小时；3000rpm离心10分钟，收集沉淀1，上清继续加入硫酸铵粉末至60% (w/v),静置2小时后，3000rpm离心10分钟，收集沉淀2。测定沉淀I与沉淀2中，UK和UTI的活性，见表I。表1:Iuk总活性(u) Iuti总活性(u)|始 3.15 X IO52.33 X IO5 _定 I 3.03 X IO56.51X IO32 I未检出|2.15X105 —从表I可见，UK主要集中在沉淀I中，收率约95%，UTI主要集中在沉淀2中，收率大于90%。起始所用的UK粗品比活为210U/A28Q，沉淀I的比活为650 U/A280,比活明显提闻。实施例2将10克UK粗制品(3.72万U/g)和10克UTI粗制品(1.95万U/g)混合，加IOOml的去离子水，搅拌溶解，离心收集上清液93ml，上清液用IN的NaOH溶液调节pH至9.6 ;缓慢加入30% (w/v)硫酸铵粉末，一边加硫酸铵粉末，一边搅拌使其溶解，再用IN的NaOH溶液调节PH至9.6，静置6小时；3000rpm离心10分钟，收集沉淀1，上清继续加入硫酸铵粉末至55% (w/v)，静置2小时后，3000rpm离心10分钟，收集沉淀2。测定沉淀I与沉淀2中，UK和UTI的活性，见表2。表2:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种尿激酶与人尿胰蛋白酶抑制剂的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将含有尿激酶和人尿胰蛋白酶抑制剂的溶液，调节pH至9.0±0.6；2)缓慢加入16－30％（w/v）硫酸铵粉末，一边加硫酸铵粉末，一边搅拌使其溶解，直到溶液中出现明显蛋白沉淀；3)调节pH至9.0±0.6；4)静置1－6小时后，离心或者加硅藻土过滤，收集富含尿激酶的沉淀1，获得尿激酶；5)上清继续加入硫酸铵至55％（w/v）以上，一边加硫酸铵粉末，一边搅拌使其溶解；6)静置1－6小时后，离心或者加硅藻土过滤，收集富含人尿胰蛋白酶抑制剂沉淀2，获得人尿胰蛋白酶抑制剂。

【技术特征摘要】
1.一种尿激酶与人尿胰蛋白酶抑制剂的分离方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)将含有尿激酶和人尿胰蛋白酶抑制剂的溶液，调节pH至9.0 ±0.6 ; 2)缓慢加入16- 30% (w/v)硫酸铵粉末，一边加硫酸铵粉末，一边搅拌使其溶解，直到溶液中出现明显蛋白沉淀； 3)调节pH 至 9.0±0.6 ；4)静置I一 6小时后，离心或者加硅藻土过滤，收集富含尿激酶的沉淀1，获得尿激酶；5)上清继续加入硫酸铵至55%(w/v)以上,一边加硫酸铵粉末,一边搅拌使其溶解； 6)静置I一 6小时...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗丕渠，苏古方，许冬至，沈小宁，
申请(专利权)人：扬州艾迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：