本发明专利技术提供抗草甘膦转基因大豆种子中kunitz型胰蛋白酶抑制剂的多级质谱鉴定方法，其主要的技术要点是高纯度富集大豆种子中kunitz型胰蛋白酶抑制剂，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术，结合基因组学和蛋白质组学分析，建立转基因大豆和非转基因大豆种子中kunitz型胰蛋白酶抑制剂的肽指纹图谱，通过指纹图谱的比较为鉴定抗草甘膦转基因大豆提供一种新的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗草甘膦转基因大豆种子中kunitz型胰蛋白酶抑制剂的分离富集及多级质谱鉴定方法。
技术介绍
自抗草甘膦转基因大豆商品化以来，已经建立了不少的检测方法，以检测核酸为目标的各种PCR检测技术以及PCR快速检测试剂盒；以检测外源蛋白为目标的ELISA检测技术以及酶联免疫快速检测试纸条、试剂盒，这些检测方法都可以为鉴定转基因作物以及为转基因作物的环境安全评价提供技术支持。但是自中国2009年批准转基因水稻和转基因玉米生产安全证书的释放，成为第一个批准主粮商业化种植的国家后，对转基因作物安全性评价、特别是转基因作物在食品安全性评价方面提出更高的要求。抗草甘膦转基因大豆是最早开始商业化种植的的转基因作物，随着转基因大豆在我国饲料、食用油原料中使用量的不断增加，转基因大豆带来的食品安全问题成为广大消费者关注的焦点。生物信息是按DNA→mRNA→蛋白质→代谢产物方向流动的，蛋白质和各类代谢物是最终与人类食用直接关联的物质形态，因此，对转基因作物蛋白组、代谢物的分离鉴定，检测分析可以为食品安全相关预警信号提供一个预知平台，也可以为转基因产品在安全性评价方面提供一种新的技术。代谢物检测通常有两种方法，一种方法称作代谢物指纹分析(Metabolomicfingerprinting)，采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)的方法，比较不同样品中各自的代谢产物以确定其中所有的代谢产物。代谢指纹分析涉及比较不同个体中代谢产物的质谱峰，最终了解不同化合物的结构，建立一套完备的识别这些不同化合物特征的分析方法。另一种方法是代谢轮廓分析(Metabolomicprofiling)，研究人员假定了一条特定的代谢途径，并对此进行更深入的研究，再结合模式识别方法，有可能找出与之相关的生物标志物(Biomarker)。用于代谢物检测的主要技术手段是核磁共振(NMR)，质谱(MS)，色谱(HPLC，GC)。对于代谢产物来说，不仅只有质谱峰这个特征，由于质谱只能检测离子化的物质，但有些代谢产物在质谱仪中不能被离子化，因此，质谱(MS)并不能检测出所有的代谢产物。此外，质谱分析发现，代谢产物的同质性不高，由于缺乏均匀性，使色谱分析变得更加困难，无法识别出样品中的未知物质。采用核磁共振(NMR)的方法，可以弥补色谱的不足，但由于核磁共振检测的灵敏度不高，所以只用于分析低丰度代谢产物。由于蛋白质的复杂性，为了满足蛋白质检测快速、大规模和准确的要求，生物质谱技术成为了蛋白质组学研究的必然选择。随着生物化学的飞速发展，电喷雾离子化质谱以及基质辅助激光解吸离子化质谱得到了显著的发展，使得质谱能够对生物大分子进行检测和鉴定。由于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)具有很多优势，例如高准确性、高分子量检测能力(理论上MALDI-TOF-MS无检测上限)、高检测灵敏度和对离子、缓冲液较强的忍耐性以及可对混合物的直接分析，使得基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在生物化学领域、临床医学领域和高分子聚合物的研究中得到了快速的发展和广泛的应用。将基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱应用于蛋白质肽谱分析，为蛋白质的表征和鉴定提供了一种强有力的手段和工具。大豆中胰蛋白酶抑制剂是大豆种子中主要的抗营养因子，转基因大豆中抗除草剂蛋白在大豆体内的活性是否会对蛋白酶抑制剂的表达产生影响，从而使抑制剂的种类含量发生变化是直接影响大豆的食用安全性问题。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析技术，结合基因组学和蛋白质组学的方法，建立大豆中Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的多级质谱鉴定方法，分析比较转基因大豆和非转基因大豆胰蛋白酶抑制剂肽段质谱图的差异，为鉴定抗草甘膦转基因大豆提供一种新方法，也为转基因大豆的安全性评价提供新手段。
技术实现思路
本专利技术提供一种抗草甘膦转基因大豆种子中kunitz型胰蛋白酶抑制剂的分离富集方法及Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的多级质谱鉴定方法，其主要的技术要点在于：1、抗草甘膦转基因大豆种子中kunitz型胰蛋白酶抑制剂的高效富集1)利用葡聚糖凝胶(SephadexG-75)-分子筛凝胶过滤层析，从胰蛋白酶抑制剂粗提物中初步分离纯化得到kunitz型胰蛋白酶抑制剂。2)利用胰蛋白酶-琼脂糖凝胶4B为亲和介质进行亲和层析纯化，富集高纯度的kunitz型胰蛋白酶抑制剂。2、MALDI-TOF-MS测定大豆kunitz型胰蛋白酶抑制剂MALDI-TOF-MS检测大豆kunitz型胰蛋白酶抑制剂蛋白样品中，非转基因大豆质谱图有四个信号峰，分别为15739.276m/z、19964.628m/z、20077.782m/z、20284.003mn/z；转基因大豆质谱图也有四个信号峰，分别为15377.423m/z、15747.264m/z、15883.453m/z、19965.445m/z。3、MALDI-TOF-MS测定大豆kunitz型胰蛋白酶抑制剂肽指纹图谱对kunitz型胰蛋白酶抑制剂的肽段进行MALDI-TOF-MS检测，转基因大豆与其亲本相比存在相同的信号峰，分别为1656m/z、1738/1739m/z、2277m/z、2413m/z，同时质荷比为2445m/z的信号峰与其亲本在1568m/z、2703m/z处信号峰存在区别。具体实施方式实施例1、大豆kunitz型胰蛋白酶抑制剂的凝胶过滤层析纯化称取10g葡聚糖凝胶G-75(superdexG-75)溶解在250ml去离子水中，充分混匀后在100℃水浴中蒸煮3h进行充分溶胀。将溶胀好的凝胶连续沿壁缓缓倒入层析柱(直径20mm、柱长60cm)中，待底部自然沉降一定量的凝胶以后，打开柱子下端的流出口，直至凝胶沉积到所需要的高度。用5倍柱体积的去离子水平衡层析柱，使凝胶床稳定，并放一个面积相当的滤纸片。胶面上方保持2～3cm高度的缓冲液。称取50mg大豆kunitz型胰蛋白酶抑制剂粗提物用5ml去离子水充分溶解，4℃下10000×g离心5min备用。关闭层析柱的出口，吸出胶面上存留的去离子水，加入5ml样品溶液，用缓冲液冲洗凝胶上方的柱子内壁，待样品全部进入柱床内加入2cm高的缓冲液层，连上缓冲液贮存器，打开出口阀，控制流速在0.7ml/min。用干净的试管分部收集(7ml)流出液，检测活性后真空冷冻干燥，置-20℃下储存备用。实施例2、大豆kunitz型胰蛋白酶抑制剂的亲和层析纯化将胰蛋白酶-琼脂糖凝胶4B45ml连续沿壁缓缓注入层析柱(柱长25cm、直径20mm)中，用5倍柱床体积的结合缓冲液(pH＝8.5)平衡层析柱，称取分子筛凝胶过滤层析纯化的大豆样品溶于结合缓冲液(pH8.5)上柱，每15ml后用结合缓冲液冲洗柱子，直至流出液在280nm处的吸光度小于0.02，重复三次分批上样，总上样量为45ml，同时收集各穿透峰洗液。然后用2倍柱床体积的去离子水冲洗柱子。再用0.05mol/L甘氨酸-HCl溶液(pH＝2.0)进行洗脱，流速0.5ml/min收集洗脱液，用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节pH值为中性，透析除盐，真空冷冻干燥后纯化得到kunitz型胰蛋白酶抑制剂。实施例3、MALD本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可以检测转基因大豆种子中kunitz型胰蛋白酶抑制剂的多级质谱鉴定方法，其特征在于以高纯度富集的大豆种子中kunitz型胰蛋白酶抑制剂为样品，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI‑TOF‑MS)分析技术，结合基因组学和蛋白质组学的方法，建立大豆种子中kunitz型胰蛋白酶抑制剂的肽指纹图谱，提供通过指纹图谱比较鉴定转基因大豆的新方法。
【技术特征摘要】
1.一种可以检测转基因大豆种子中kunitz型胰蛋白酶抑制剂的多级质谱鉴定方法，其特征在于以高纯度富集的大豆种子中kunitz型胰蛋白酶抑制剂为样品，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析技术，结合基因组学和蛋白质组学的方法，建立大豆种子中kunitz型胰蛋白酶抑制剂的肽指纹图谱，提供通过指纹图谱比较鉴定转基因大豆的新方法。2.权利要求1所述及高纯度kunitz型胰蛋白酶抑制剂的分离富集方法包括，使用葡聚糖凝胶(SephadexG-75)-分子筛凝胶过滤层析及胰蛋白酶-琼脂糖凝...
【专利技术属性】
技术研发人员：王俊英，王俊平，林敏，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。