一种从大豆乳清中回收Kunitz及Bowman−Birk型胰蛋白酶抑制剂的方法，属于农产品加工及副产品综合利用领域。本发明专利技术方法包括以下步骤：（1）大豆乳清的预处理；（2）大豆乳清蛋白的初级分离；（3）大豆乳清蛋白与聚阴离子多糖复凝聚；（4）回收Kunitz及Bowman−Birk型胰蛋白酶抑制剂。原料预处理，初级分离后经复凝聚得到终蛋白多糖复合物，终蛋白多糖复合物经超滤除糖，超滤脱盐，二次离心后即得含有纯化Kunitz及Bowman−Birk型胰蛋白酶抑制剂的蛋白溶液，该蛋白溶液经过真空冷冻干燥得到Kunitz及Bowman−Birk型胰蛋白酶抑制剂高纯度样品。本发明专利技术对大豆乳清综合利用，设备要求低，操作简单，无环境污染。且胰蛋白酶抑制剂回收率高，纯度高，蛋白活性高。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种从大豆乳清中回收Kunitz及Bowman?Birk型胰蛋白酶抑制剂的方法，属于农产品加工及副产品综合利用领域。本专利技术方法包括以下步骤：（1）大豆乳清的预处理；（2）大豆乳清蛋白的初级分离；（3）大豆乳清蛋白与聚阴离子多糖复凝聚；（4）回收Kunitz及Bowman?Birk型胰蛋白酶抑制剂。原料预处理，初级分离后经复凝聚得到终蛋白多糖复合物，终蛋白多糖复合物经超滤除糖，超滤脱盐，二次离心后即得含有纯化Kunitz及Bowman?Birk型胰蛋白酶抑制剂的蛋白溶液，该蛋白溶液经过真空冷冻干燥得到Kunitz及Bowman?Birk型胰蛋白酶抑制剂高纯度样品。本专利技术对大豆乳清综合利用，设备要求低，操作简单，无环境污染。且胰蛋白酶抑制剂回收率高，纯度高，蛋白活性高。【专利说明】一种从大豆乳清中回收Kun i tz及Bowman-B i rk型胰蛋白酶抑制剂的方法
本专利技术涉及大豆乳清蛋白的回收方法，具体是指一种利用聚阴离子多糖回收大豆乳清中的Kunitz及Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制剂的方法，属于农产品加工及副产品综合利用领域。
技术介绍
大豆乳清蛋白是残存于大豆乳清中不能为酸所沉淀的蛋白质，在大豆乳清蛋白中2S组分所占的比重较大；乳清蛋白质中除含有球蛋白、白蛋白之外，还主要含有:①Kunitz胰蛋白酶抑制剂(KTI，ρΗ3.0-10.0，20kDa)；②Bowman-Brik胰蛋白酶抑制剂(BBI，pH3.0-10.0,20KDa) ；(3) β -淀粉酶(61.7KDa) 凝集素(pH2.2-10.8,120KDa) 脂氧合酶(L0X，102KDa)等多种生理活性物质，约占大豆蛋白的9%_15.3%。 在医学和生物学中，抑制剂已成为蛋白水解研宄的有用工具。由于蛋白酶抑制剂在控制涉及一些疾病如膜腺炎、休克和肺气肿的蛋白酶方面，以及作为调节剂用于调节哺乳动物受精作用方面的治疗潜力，它们是尤其受关注的。蛋白酶抑制剂已知至少抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及可能抑制调控一些关键代谢功能的多种其它关键跨膜蛋白酶。蛋白酶的局部给药对于例如特应性皮炎的病症是有用的，特应性皮炎是皮肤炎症的一种普通形式，其可以局限于少数区块或涉及身体的大部分。蛋白酶抑制剂的褪色活性和它们防止紫外线导致的色素沉着的能力在体外和体内均已被证明。蛋白酶抑制剂还被报道有利于创伤愈合。例如，分泌性白细胞蛋白酶抑制剂被证明当被局部施用时逆转了组织的破坏并加速了创伤愈合过程。此外，丝氨酸蛋白酶抑制剂还能够有助于在红斑狼疮病人中降低疼痛。 目前，大豆胰蛋白酶抑制剂抗营养作用主要表现在抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性、降低蛋白质消化吸收和造成胰腺肿大两个方面。这些被认为影响人类消化吸收的具有生物活性的大豆乳清蛋白，现在对预防治疗某些疾病具有显著效果，这使得大豆乳清成为一种有效的原料来源。例如，低浓度的胰蛋白酶抑制剂是广谱抗致癌因子，能预防结肠癌、肝癌、口腔癌、肺癌等多种癌症的发生，还有降低胆固醇水平的作用；能增强胰脏生长和增加胰消化酶的活性，且对动物内皮细胞生长因子具有活化作用；能控制肾小球肾炎或肾盂肾炎的一些炎症发展过程。此外，微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调有一定效果。医药上提取胰蛋白酶抑制剂(抑肽酶)治疗急性胰腺炎。 已有大量文献报道了大豆乳清蛋白的回收方法。CN1954689和CN1364765公开的膜分离制备和提取大豆乳清蛋白的方法。例如CN1537865公开的从大豆黄浆水提取乳清蛋白、核酸等成分；CN1027812公开了了从乳清工艺流中回收和分离大豆乳清蛋白和其它组分的方法。CN102746375公开的一种具有抗肿瘤作用的大豆乳清蛋白的制备方法。现有技术均采用膜分离或者离子交换层析等方法，一般具有复杂纷繁的流程。本专利技术采用了天然可食性的聚阴离子多糖作为回收材料，充分利用蛋白与多糖的复凝聚原理，其形成的复凝聚物既可以作为食品材料直接利用，也可以完整实现蛋白与多糖的分离。从资源回收利用的角度来看，本专利技术不仅可以有效降低大豆乳清的抗营养组分，还可以制备具有高纯度及生理活性的两种胰蛋白酶抑制剂组分。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简单易于操作的实验室规模制备回收并纯化Kunitz(KTI)及Bowman -Birk (BBI)型胰蛋白抑制剂的方法，该专利技术制备的KTI及BBI纯度约90%-93%，仍然保持天然的胰蛋白酶抑制剂活性。 本专利技术的技术方案:一种从大豆乳清中回收Kunitz及Bowman -Birk型胰蛋白酶抑制剂的方法，步骤为:(1)大豆乳清的预处理:将大豆乳清调至pH4.5-4.8，9500rpm离心30min除沉淀；再次调至pH 8.0-10.0，9500rpm离心30min，收集上清液，得试验用大豆乳清液；用pH调节剂调节pH ；(2)大豆乳清蛋白的初级分离:量取一定体积的上述大豆乳清液，调节pH至4.5-5.0，在4-30°C下，加入硫酸钱至终饱和度为30%-40%，9500rpm离心30min，收集沉淀，加入去离子水溶解，使蛋白质量终浓度为1%_10%，截留分子量3500透析脱盐36-48h，截留液真空冷冻干燥，获得含有Kunitz及Bowman - Birk型两种胰蛋白酶抑制剂的大豆乳清蛋白组分；(3)大豆乳清蛋白与聚阴离子多糖复凝聚:将步骤(2)制备的大豆乳清蛋白组分，用去离子水配制w/v终浓度为0.1%-0.4%的大豆乳清蛋白溶液，调节pH至7.0，并同时配制w/v0.l%-0.4%的聚阴离子多糖溶液，调节pH至7.0 ;向上述大豆乳清蛋白溶液中缓慢加入v/v 2.5% -10%的聚阴离子多糖溶液，调节pH至5.0-3.0，4000rpm离心20min，收集沉淀；对上清液再次加聚阴离子多糖溶液重复沉淀1-2次，合并沉淀物，即得Kunitz型胰蛋白酶抑制剂与聚阴离子多糖的复凝聚物；合并上述去沉淀后的上清液，继续缓慢加入v/v 5% -10%的聚阴离子多糖溶液，调节pH至4.5-3.8，4000rpm离心20min，收集上清液，即得含有Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制剂与聚阴离子多糖的复合物溶液。 (4)回收Kunitz及Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制剂:将得到的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂/聚阴离子多糖的复凝聚物悬浮于2-3倍体积的去离子水中，调节pH至7.0-9.0，过超滤膜100kD-300kD除糖，收集滤过液；截留分子量3000-4000超滤脱盐，截留液真空冷冻干燥，即得纯化的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂；将得到的Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制剂/聚阴离子多糖的复合物溶液，调节pH至7.0-9.0，过超滤膜100kD-300kD除糖，收集滤过液；截留分子量3000-4000超滤脱盐，截留液真空冷冻干燥，即得纯化的Bowman - Birk型胰蛋白酶抑制剂。 所述pH调节剂为:酸性:有机酸:包括但不限于甲酸、乙酸；无机酸:包括但不限于盐酸，硫酸；优先选择无机酸；碱性:包括但不限于氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸氢钠，优先选择氢氧化钠；所述聚阴离子多糖包括但不限于:卡拉胶，硫酸酯化半乳聚糖及其它硫酸酯化多本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从大豆乳清中回收Kunitz及Bowman −Birk型胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于步骤为：（1）大豆乳清的预处理：将大豆乳清调至pH 4.5‑4.8，9500rpm离心30min除沉淀；再次调至pH 8.0‑10.0，9500rpm离心30min，收集上清液，得试验用大豆乳清液；用pH调节剂调节pH；（2）大豆乳清蛋白的初级分离：量取一定体积的上述大豆乳清液，调节pH至4.5‑5.0，在4‑30℃下，加入硫酸铵至终饱和度为30%‑40%，9500rpm离心30min，收集沉淀，加入去离子水溶解，使蛋白质量终浓度为1%‑10%，截留分子量3500透析脱盐36‑48h，截留液真空冷冻干燥，获得含有Kunitz及Bowman −Birk型两种胰蛋白酶抑制剂的大豆乳清蛋白组分；（3）大豆乳清蛋白与聚阴离子多糖复凝聚：将步骤（2）制备的大豆乳清蛋白组分，用去离子水配制w/v终浓度为0.1%‑0.4%的大豆乳清蛋白溶液，调节pH至7.0，并同时配制w/v 0.1%‑0.4%的聚阴离子多糖溶液，调节pH至7.0；向上述大豆乳清蛋白溶液中缓慢加入v/v 2.5% ‑10%的聚阴离子多糖溶液，调节pH至5.0‑3.0，4000rpm离心20min，收集沉淀；对上清液再次加聚阴离子多糖溶液重复沉淀1‑2次，合并沉淀物，即得Kunitz型胰蛋白酶抑制剂与聚阴离子多糖的复凝聚物；合并上述去沉淀后的上清液，继续缓慢加入v/v 5% ‑10%的聚阴离子多糖溶液，调节pH至4.5‑3.8，4000rpm离心20min，收集上清液，即得含有Bowman −Birk型胰蛋白酶抑制剂与聚阴离子多糖的复合物溶液；（4）回收Kunitz及Bowman −Birk型胰蛋白酶抑制剂：将得到的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂/聚阴离子多糖的复凝聚物悬浮于2‑3倍体积的去离子水中，调节pH至7.0‑9.0，过超滤膜100kD‑300kD除糖，收集滤过液；截留分子量3000‑4000超滤脱盐，截留液真空冷冻干燥，即得纯化的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂；将得到的Bowman −Birk型胰蛋白酶抑制剂/聚阴离子多糖的复合物溶液，调节pH至7.0‑9.0，过超滤膜00kD‑300kD除糖，收集滤过液；截留分子量3000‑4000超滤脱盐，截留液真空冷冻干燥，即得纯化的Bowman −Birk型胰蛋白酶抑制剂。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张彩猛，华欲飞，李兴飞，孔祥珍，陈业明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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