本发明专利技术涉及工程菌酿酒酵母和植物基因工程领域。本发明专利技术提供了水稻胰蛋白酶抑制剂OsBBTI4基因在水稻中降低重金属镉积累的应用，其cDNA全长序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术OsBBTI4基因编码的蛋白质OsBBTI4与水稻对重金属镉的积累相关。通过将OsBBTI4基因在水稻中转基因超表达或RNAi，调控转基因水稻株系中OsBBTI4基因的表达量，可以影响转基因水稻种子中镉含量，得到低镉富集的转基因水稻品系。OsBBTI4基因可应用于工程菌及水稻针对体内镉含量改变的遗传工程育种，也可应用于其他植物的针对体内镉富集的遗传工程育种。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因工程领域，具体涉及水稻胰蛋白酶抑制剂OsBBTI4(OryzasativaBowman-Birktrypsininhibitor4)及其编码基因和在调控水稻镉积累方面的应用。
技术介绍
重金属镉是一种生物体非必需的毒性元素。随着现代社会的发展，环境污染越来越严重，由地壳释放到水、大气和土壤中的具有毒性的活性镉离子也越来越多。这些镉离子进入生物圈，并通过食物链进入人体，严重危害人体健康。水稻是一种重金属镉富集的农作物。2014年4月，国土资源部和环境保护部公布数据表明，我国土地的重金属污染十分严重，按照点位超标率计算，我国土壤中镉超标的土地已达我国国土总面积的7％。按照污染发生的地区来看，重金属污染则主要分布于我国的华中华南地区、泛珠三角地区、长三角地区及东北地区，这些地区均为我国水稻的主要产区，严重影响我国的水稻粮食安全。近年来，由媒体报道的稻米镉超标事件层出不穷，引起了民众巨大的恐慌。蛋白酶抑制剂在植物中普遍存在，通过调控蛋白酶活性应答多种细胞生理反应，包括植物生长发育、抗病性及逆境胁迫应答。BBI(Bowman-BirkInhibitor)是植物中的蛋白酶抑制剂的一种，其抑制的蛋白酶包括胰蛋白酶，糜蛋白酶和弹性蛋白酶等丝氨酸蛋白酶。BBI蛋白富含半胱氨酸，含有1-3个BBI的结构域，该结构域的分子量约为7-8kD，有两个独立的活性位点，可以同时抑制两个不同的蛋白酶分子，通过充当蛋白酶的假底物而抑制蛋白酶活性。根据含有BBI结构域的数目，BBI蛋白的分子量分别为8kD，16kD和24kD左右。目前已在豆科和禾本科植物中均克隆到了编码BBI蛋白的基因，其中豆科植物中的BBI蛋白因具有明显的抑癌特征而得以广泛的研究。植物中的BBI蛋白是由多基因的基因家族编码的，根据其BBI结构域中两个活性位点抑制底物的特异性，大豆中的BBI蛋白可分为三类：BBI-A、BBI-C和BBI-D。BBI-A的两个活性位点分别抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，BBI-C的两个活性位点分别抑制胰蛋白酶和弹性蛋白酶活性，而BBI-D则分别抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。研究表明，大豆中BBI蛋白的生物学功能包括：调节种子萌发过程中內源蛋白酶活性；在种子休眠期储藏还原性的硫氨基酸(如半胱氨酸)；保护植物免受昆虫和其他病原微生物的侵害等。BBI基因也参与应答多种逆境胁迫，其表达可以受到生物逆境、非生物逆境及激素的诱导。水稻OsBBPI基因是单子叶植物中克隆的第一个BBI基因(U76004)，研究表明，该基因表达受光调节，且在叶片中的表达受到切割伤害、茉莉酸和乙烯的诱导。水稻BBI基因的表达受到褐飞虱的诱导，表明该基因可能参与应答水稻对褐飞虱的伤害胁迫反应。绞股蓝CjBBI基因在酵母中表达可以提高酵母对重金属Cd和药物的耐受性，并且其表达受Cd胁迫的诱导。小麦BBI基因wali3，wali5和wali6的表达受伤害、铝毒的诱导，而另一个小麦BBI基因——WRSI5的表达受盐胁迫、铝毒和PEG胁迫的诱导，且在拟南芥转基因超表达WRSI5基因会提高转基因拟南芥的耐盐性。在我们的前期研究中，我们一直致力于分离水稻中应答重金属镉胁迫及参与调控镉积累的水稻基因。我们通过构建水稻幼苗cDNA的酵母表达文库，通将该文库质粒转化于酵母对镉敏感的突变株Δycf1，获得了能够提高酵母镉耐受性的水稻cDNA克隆OsBBTI4(Bowman-Birktrypsininhibitor4)。然而，即使知道OsBBTI4基因镉耐受性，因其是两种机制，并不能推知OsBBTI4基因对水稻镉积累的作用。在本专利技术中，我们描述了该基因的表达能够影响重金属镉在生物体内的积累，提供了将该基因应用于重要粮食作物——水稻的低镉遗传育种技术，本专利技术也可应用于工程菌——酿酒酵母的低镉遗传改造。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种水稻蛋白酶抑制剂OsBBTI4及其编码基因OsBBTI4的新应用。实现上述目的的技术方案如下。氨基酸序列如SEQIDNO.2的水稻蛋白酶抑制剂OsBBTI4和/或OsBBTI4基因在水稻中降低重金属镉积累的应用，所述OsBBTI4基因的cDNA为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.2的核苷酸序列。本专利技术的水稻胰蛋白酶抑制剂OsBBTI4，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，其编码基因OsBBTI4的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本专利技术的保护范围内。本专利技术的另一目的是提供一种OsBBTI4的水稻超表达载体，该表达载体克隆有上述水稻OsBBTI4基因，能够使OsBBTI4在水稻体内超量表达，并使水稻降低转基因种子中的重金属镉的含量。实现上述目的的技术方案如下。水稻超表达载体核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的OsBBTI4基因的水稻超表达载体。优选地，所述超表达载体为pCU1301，基因插入位点为BamHI。本专利技术的另一目的是提供上述水稻超表达载体的制备方法。实现该目的的技术方案如下。一种上述水稻超表达载体的制备方法，包括以下步骤：(1)以水稻基因组DNA为模板，以SEQIDNO.3和SEQIDNO.4为引物，进行扩增，回收扩增产物；(2)对水稻转基因超表达载体pCU1301进行BamHI酶切处理，回收线性化pCU1301载体；(3)将扩增产物与线性化的pCU1301载体连接，鉴定阳性克隆并提取质粒OsBBTI4-pCU1301，即得。本专利技术的另一目的是提供上述水稻超表达载体的应用。上述水稻超表达载体在水稻中降低重金属镉积累的应用。本专利技术的另一目的是提供一种RNAi表达载体，该表达载体克隆有上述针对水稻胰蛋白酶抑制剂基因OsBBTI4的RNA干涉片段。实现该目的的技术方案如下。插入有核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的OsBBTI4基因的RNAi表达载体。优选地，所述表达载体为pTCK303。本专利技术的另一目的是提供上述RNAi表达载体的制备方法。实现该目的的技术方案如下。RNAi表达载体的制备方法，包括有以下步骤：(1)以水稻基因组DNA为模板，以SEQIDNO.5和SEQIDNO.6为引物，进行扩增，回收扩增产物；(2)将扩增产物连接于pGEMT-Vector上形成pGEMT-BBTI4RI；...
【技术保护点】
氨基酸序列如SEQ ID NO.2的水稻蛋白酶抑制剂OsBBTI4和/或OsBBTI4基因在水稻中降低重金属镉积累的应用，所述OsBBTI4基因的cDNA为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.氨基酸序列如SEQIDNO.2的水稻蛋白酶抑制剂OsBBTI4和/或OsBBTI4基因在水稻中降低重金属镉积累的应用，所述OsBBTI4基因的cDNA为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.2的核苷酸序列。
2.插入有核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的OsBBTI4基因的水稻超表达载体。
3.根据权利要求2所述的水稻超表达载体，其特征是，所述超表达载体为pCU1301，基因插入位点为BamHI。
4.权利要求2所述的水稻超表达载体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)以水稻基因组DNA为模板，以SEQIDNO.3和SEQIDNO.4为引物，进行扩增，回收扩增产物；
(2)对水稻转基因超表达载体pCU1301进行BamHI酶切处理，回收线性化pCU1301载体；
(3)将扩增产物与线性化的pCU1301载体连接，鉴定阳性克隆并提取质粒OsBBTI4-pCU1301，即得。
5.权利要求2所述水稻超表达载体在水稻中降低重金属镉积累的应用。
6.插入有核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的OsBBTI4基因的RNAi...
【专利技术属性】
技术研发人员：张美，孙雯，王晶，郭艳，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东;44
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