一种用竹笋提取胰蛋白酶抑制剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种用竹笋提取胰蛋白酶抑制剂的方法。它是将竹笋去皮用水清洗干净切片，然后按竹笋：水质量体积比1g：1-5ml将切片的竹笋加入到水中，然后磨碎，再在60-90℃下反应3-30min，过滤，去渣取滤液，边搅拌边向滤液中加入600-750g/L的硫酸铵溶液，直至溶液澄清，置于3-7℃下8-12小时，然后离心，去掉上清液，将沉淀物再溶解于水中，然后经葡聚糖凝胶G25柱，用水洗脱，洗脱馏分经浓缩后再经葡聚糖凝胶G50柱，用水洗脱，洗脱馏分再经二乙二胺乙基纤维素-葡聚糖凝胶A50，用0.1g/L-0.3g/L的NaCl溶液梯度洗脱，收集0.12-0.15g/L的梯度洗脱馏分，即得到胰蛋白酶抑制剂。本发明专利技术可开发出高附加值的竹笋产品，提高竹笋加工业的经济效益，提高资源利用效率，带动竹产业发展和农村经济的繁荣。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于蛋白制备领域，具体涉及一种用竹笋提取胰蛋白酶抑制剂的方法。
技术介绍
：我国拥有十分丰富的竹类资源，主要分布于福建、江西、浙江等省。竹笋是竹鞭或秆基上的芽萌发分化而成的膨大的芽和幼嫩的茎，是一种高蛋白低脂肪的森林蔬菜。随着笋用林和笋竹两用林丰产技术的推广，我国鲜笋产量逐年递增，2006年产竹笋500万～600万吨，除40％鲜销外，其余均用于罐头笋和笋干的加工。但是，近年来由于传统笋产品市场趋于饱和，市场竞争激烈，导致相关企业经济效益低下，鲜笋原料价格偏低，农民增产不增收。此外，传统笋加工会产生笋头、笋壳和笋煮液等大量废弃物，导致资源浪费和环境污染。因此，要将资源优势转化为经济优势实现竹笋加工剩余物的综合利用，就要研究挖掘全笋的营养价值和药用价值，重视产品创新，研发竹笋深加工产品，提升竹笋的附加值。这对竹笋产业的可持续发展具有重要意义。据报道，在竹笋中蛋白质含量较高，每100g鲜竹笋含有蛋白质高达2.65g。竹笋中用于制作笋罐头、笋干等笋制品的笋肉只占笋体很少一部分。以毛竹笋为例，其笋肉只占30％，其余均为笋头和笋壳等下脚料，其比例高达70％，而这些下脚料的营养成分多数并不会比笋肉低。竹笋中含氮物质丰富，因此利用竹笋、笋渣、笋壳生产或提取特殊用途的氨基酸、多肽、蛋白质是研究者关注的焦点。文献报道，利用DEAE-纤维素柱色谱、亲和层析柱和阳离子交换柱从新鲜竹笋里分离得到一种分子量为20kDa的抗真菌蛋白(Dendrocin)，它能抑制菌丝体的生长，经分析其N端序列与拟甜蛋白相似，这种蛋白不像其他抗菌蛋白一样具有红细胞凝集和核糖核酸酶活性。日本科学家Masatoshi等利用亲和色谱从毛竹笋中分离得到了2种具有抗致病菌和抗真菌功能的多肽，被分别命名为Pp-AMP1和Pp-AMP2，其氨基酸序列分析发现其与槲寄生毒素具有高度同源性。武汉大学生命科学学院罗曼等采用挥发性酸和碱调节鲜笋壳压榨液pH值，分别获得无盐的Fraction-I和Fraction-Ⅱ，其压榨后的汁液，加入Fe2+并超滤浓缩，经硫酸铵盐析和丙酮分级后，用CM-22纤维素离子交换柱层析，以pH值5.2的乙酸钠溶液分级洗脱，获得高纯竹笋过氧化物酶。提示了罐头笋加工尾料可通过系统的生化工程处理,获得高附加值的酶制剂。浙江大学张英等、黄伟等利用竹笋加工废弃物-笋煮液或笋浸泡液，结合组合式膜技术、电渗析等工艺技术，制备出竹笋氨基酸肽类提取物，其中氨基酸总量(以干基计)一般在20％～40％，游离氨基酸含量占10％～30％，并含有0.5％～1.0％的δ-羟基赖氨酸,氨基酸组成以酪氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、δ-羟基赖氨酸等为主。该产品具有良好的感官品质和浓郁的鲜味，可广泛用于功能性食品、饮品和调味品等。中国林业科学研究院亚热带林业研究所张金萍等采用等电点沉淀法、乙醇胺复溶-沉淀法从毛竹春笋(或笋加工废液)中分离、精制酪氨酸，纯度大于98.5％。胰蛋白酶抑制剂是具有抑制胰蛋白酶作用的一类物质，是人类重要的药物资源，具有广阔的应用前景。蛋白的酶水解在一系列生理过程如消化中扮演着重要的角色，而该反应则受蛋白酶抑制剂的调控。添加到食品及食品成分中的抑制剂，能减少游离氨基酸的吸收，抑制生产中的蛋白水解反应。抑制剂可作为一种有利的手段，用于控制害虫、预防和治疗疾病(如癌症和艾滋病)，以及抑制食品加工中不受欢迎的蛋白酶催化反应等。此外，蛋白酶抑制剂也可作为有价值的生化工具，用干蛋白酶的种类和特性研究。天然的胰蛋白酶抑制剂存在于鸟蛋、大豆、红花豆和马铃薯中。目前生产上主要利用大豆来提取。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种用竹笋提取胰蛋白酶抑制剂的方法，利用该方法能够高效的提取到胰蛋白酶抑制剂，提取的胰蛋白酶抑制剂纯度高，从而实现了竹笋资源利用效率，促进竹笋综合利用技术提升，带动竹产业发展。本专利技术的用竹笋提取胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：将竹笋去皮用水清洗干净切片，然后按竹笋：水质量体积比1g：1-5ml将切片的竹笋加入到水中，然后磨碎，再在60-90℃下反应3-30min，过滤，去渣取滤液，边搅拌边向滤液中加入600-750g/L的硫酸铵溶液，直至溶液澄清，置于3-7℃下8-12小时，然后离心，去掉上清液，将沉淀物再溶解于水中，然后经葡聚糖凝胶G25柱，用水洗脱，洗脱馏分经浓缩后再经葡聚糖凝胶G50柱，用水洗脱，洗脱馏分再经二乙二胺乙基纤维素-葡聚糖凝胶A50，用0.1g/L-0.3g/L的NaCl溶液梯度洗脱，收集0.12-0.15g/L的梯度洗脱馏分，即得到胰蛋白酶抑制剂。优选，所述的将沉淀物再溶解于水中，优选是将沉淀物再溶解于水中使蛋白质浓度为质量百分数1％。本专利技术主要运用物理化学、有机化学、生物化学、现代分离技术等相关理论和方法，研究竹笋降解分离提纯最佳工艺方案：即将竹笋去壳清洗干净切碎，加水磨碎成浆，浆液加热后过滤去渣，再加入硫酸铵，低温过夜，离心去清液，柱分离，得到胰蛋白酶抑制剂。本专利技术的方法简单合理，有效利用了竹笋中的蛋白质资源，用本专利技术可以开发出高附加值的竹笋产品，提高竹笋加工业的经济效益，提高资源利用效率，促进竹笋综合利用技术提升，带动竹产业发展和农村经济的繁荣。附图说明：图1是蛋白的SDS-PAGE图，其中1、粗提竹笋胰蛋白酶抑制剂，2、纯化的胰蛋白酶抑制剂。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1竹笋去皮用水清洗干净，切成约3×5cm小片，然后按竹笋：水质量体积比1g：1ml将切片的竹笋加入到水中，用混合器磨碎，再在60℃下反应3min，过滤，去渣取滤液，边搅拌边向滤液中缓慢加入600g/L的硫酸铵溶液，直至溶液澄清，置于3℃8小时，然后将过夜后的溶液离心，去掉上清液，将沉淀物再溶解于水中，将蛋白质浓度调节至质量百分数1％，得到粗提竹笋胰蛋白酶抑制剂。取5ml上样到葡聚糖凝胶G25柱，用超纯水洗脱，洗脱馏分经浓缩成5ml，再经葡聚糖凝胶G50柱(2×93.5cm)，用超纯水洗脱，洗脱馏分浓缩后，再经二乙二胺乙基纤维素-葡聚糖凝胶A50(2.5×21cm)(先用pH为6.0的0.05MNaCl-0.01M的H3PO4缓冲液平衡)，用0.1g/L-0.3g/L的NaCl溶液梯度洗脱，收集0.12-0.15g/L的梯度洗脱馏分，即得到纯化的胰蛋白酶抑制剂，其含量如表1所示。采用BNPAN法进行胰蛋白酶抑制剂活性检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用竹笋提取胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：将竹笋去皮用水清洗干净切片，然后按竹笋：水质量体积比1g：1‑5ml将切片的竹笋加入到水中，然后磨碎，再在60‑90℃下反应3‑30min，过滤，去渣取滤液，边搅拌边向滤液中加入600‑750g/L的硫酸铵溶液，直至溶液澄清，置于3‑7℃下8‑12小时，然后离心，去掉上清液，将沉淀物再溶解于水中，然后经葡聚糖凝胶G25柱，用水洗脱，洗脱馏分经浓缩后再经葡聚糖凝胶G50柱，用水洗脱，洗脱馏分再经二乙二胺乙基纤维素‑葡聚糖凝胶A50，用0.1g/L‑0.3g/L的NaCl溶液梯度洗脱，收集0.12‑0.15g/L的梯度洗脱馏分，即得到胰蛋白酶抑制剂。

【技术特征摘要】
1.一种用竹笋提取胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将竹笋去皮用水清洗干净切片，然后按竹笋：水质量体积比1g：1-5ml将切片的竹笋加
入到水中，然后磨碎，再在60-90℃下反应3-30min，过滤，去渣取滤液，边搅拌边向滤液中
加入600-750g/L的硫酸铵溶液，直至溶液澄清，置于3-7℃下8-12小时，然后离心，去掉上
清液，将沉淀物再溶解于水中，然后经葡聚糖凝...

【专利技术属性】
技术研发人员：余能富，王玉，王小东，贺磊，黄慧，
申请(专利权)人：江西省林业科学院，
类型：发明
国别省市：江西;36