本发明专利技术涉及一种菲牛蛭(Hirudinaria manillensis)Kazal型胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM及其编码基因和应用，属生物医学技术领域。该菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM,分子量17432.8道尔顿，等电点4.84，全序列如SEQ ID NO:1所示，其第1位与第5位，第2位与第4位，第3位与第6位的半胱氨酸形成3对分子内二硫键。如SEQ ID NO:2所示编码的基因由504个核苷酸组成，其中编码成熟肽部分的为第54-501为核苷酸。本发明专利技术的有益效果在于:分离纯化得到菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM,并克隆得到其cDNA序列；该抑制剂表现出显著的胰蛋白酶抑制活性(Ki～8.45nM)，但未观察到弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶、凝血酶、血纤维蛋白溶酶、FXIIa、FXIa和FXa的抑制作用，能作为制备胰蛋白酶抑制剂的应用。
【技术实现步骤摘要】
：本专利技术提供一种菲牛蛭(Hirudinariamanillensis)Kazal型胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM及其编码基因和应用，属于生物医学
技术介绍
：蛭类是我国的一种传统中药，对于水蛭抗凝血作用的记载是公元前2世纪的“尔雅”、明朝李时珍的《本草纲目》和《神农本草经》。《本草纲目》谓其：“咸走血，苦胜血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝经血分药，故能通肝经聚血。”中医认为水蛭是一种传统的破血药，有逐瘀、通经脉、利水道的功效，主要用于治疗血瘀经闭、中风偏瘫、跌打损伤等疾病。蛭类疗法有很长的历史，在公元前1500年的埃及法老陵墓中就有使用蛭类治疗的图画。2005年，欧洲正式批准蛭类疗法为合法的治疗手段。每年仅在德国就有35万条水蛭用于医疗。菲牛蛭(Hirudinariamanillensis)，别名马尼拟医蛭，俗称金边蚂蟥。蛭纲,医蛭科牛蛭属，是目前常见吸血蛭类中个体较大的品种。该物种的模式产地在菲律宾吕宋岛。分布于印度尼西亚、菲律宾、印度、孟加拉、斯里兰卡、缅甸、泰国、越南、台湾岛以及中国大陆的福建、广东、广西、海南等地。主要栖息于弱酸性(pH值5.5～7.0)的水田、水沟或池塘里。当人畜经过时，就附着吸食血液。菲牛蛭能分泌抗凝血的物质，破坏凝血功能，因此被菲牛蛭咬过的伤口常流血不止。民间也利用这一性质，用菲牛蛭来治疗病人的局部血流不畅，但是人们对这些治疗作用的物质基础和分子机制还了解很少。丝氨酸蛋白酶抑制剂(serineproteaseinhibitor)广泛分布于动植物和微生物中，现有超过500个家族成员被发现。通过调节丝氨酸蛋白酶的活性，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与调节体内许多重要的生命活动过程，具有抗凝、抗炎、抗感染、抗肿瘤等生理活性，现已广泛应用于急性胰腺炎、外科手术、肿瘤、脑血管疾病等疾病治疗。此外，在凝血系统和补体系统中发挥作用的蛋白酶也会受丝氨酸蛋白酶抑制剂的调控以避免其蛋白酶活性对周围组织造成破坏。Kunitz,Kazal,Bowman-Birk,a-2-macroglobulin和serpin是研究较为广泛的丝氨酸蛋白酶抑制剂类型。来自欧洲医蛭的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂LDTI是第一个人类肥大细胞类胰蛋白酶紧密结合的蛋白酶抑制剂，可能作为一个药理探针来评估肥大细胞类胰蛋白酶在哮喘、关节炎、牙周疾病、皮肤疾病和血液凝固障碍中的病理生理作用。另外从欧洲医蛭中发现的BdellinB-3和日本医蛭中发现的Bdellin-KL都表现出对胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶和精子头粒蛋白的抑制作用，暗示它们可能在生物繁殖过程中起作用。目前，国内外尚未见菲牛蛭Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的有关研究报道专利技术人将本专利技术的菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。专利技术人将本专利技术的菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。
技术实现思路
：本专利技术的目的是基于上述理论研究和现有技术基础，提供一种新的具有显著胰蛋白酶抑制活性的菲牛蛭Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂Bdellin-HM及其编码基因和应用。本专利技术通过使用阴离子交换柱DEAESephadexA-50、反向高效液相色谱(RP-HPLC)C18柱和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分离纯化获得菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM。根据Edman降解法测得编码菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂的N-端部分氨基酸序列，再通过构建菲牛蛭头部cDNA文库并进行cDNA文库筛选，获得了菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂的全序列以及编码基因。该菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂是首次发现的具有Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂特点和显著胰蛋白酶抑制活性的菲牛蛭丝氨酸蛋白酶抑制剂。本专利技术的主要技术方案如下：菲牛蛭的分离纯化方法：收集的菲牛蛭头部粗提取液首先过阴离子交换柱DEAESephadexA-50，收集具有胰蛋白酶抑制活性的峰，冻干，过反向高效液相色谱(RP-HPLC)C18柱，最后将具有胰蛋白酶抑制活性峰用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测，纯化得到菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂。菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂基因的克隆包括:菲牛蛭头部总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂基因。两对扩增引物为：Primer15’-GAYWSNGARTGYGTNTGYAC-3’和Primer25’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；Primer35’-CTYACRCANACRTGNTTY-3’和Primer45’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGA-3’(R＝A/G；Y＝C/T；S＝C/G；W＝A/T；N＝A/C/G/T)。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂基因由504个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为(SEQIDNO:1):ATGAAGCTGTTGCTTGCTTTGGCCCTTTTCGGTGCATTTGTCACAATCAACGCCGACTCAGAATGTGTCTGCACCAAAGAATTGAACCAGGTTTGCGGAAGTGATGGACATACCTACGACAACCCTTGTCTAGCTACGTGCCACGGGGCGTCTGTCGCCCACGAACACGCCTGCGAAGGACACGAAGAGGAACATCACGAAGAAGACCACCATGACGGTGAGCACAATAATGGTGACCACCATGAAGGTGAGCACAATAATGGTGAACACCATGACGACGAGCACAAGGATGACCACCATGGAGAGGACCACCACGAAGACGGGGAACACAATGAAGAGCACAAGAATGACCATCACGATGATGGTCATGATGATCATCACAACAATGGCGACCACAAGGATGACCACCATGAAGAAGAACACCATGAAGAAGAACACCACGAAGGGGACCACCACGAAGAGGAGCATCACGAAGAAGAGCACAAAGACGACCATCACGATTAA其中54-501的片段编码菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂成熟肽。菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂基因作为基因工程制备菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂的应用。本专利技术的有益效果在于:分离纯化得到菲牛蛭胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM,并通过克隆得到其cDNA序列；该菲牛蛭胰本文档来自技高网...
【技术保护点】
菲牛蛭Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂Bdellin‑HM，其特征在于由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。
【技术特征摘要】
1.菲牛蛭Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂Bdellin-HM，其特征在于由SEQIDNO:1所示的
氨基酸序列组成。
2.编码菲牛蛭Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂Bdellin-HM的...
【专利技术属性】
技术研发人员：赖仞，龙承波，赖艳梅，李博文，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53
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