一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1‑抗胰蛋白酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1‑抗胰蛋白酶的方法，将Cohn组分Ⅳ沉淀依次经过Cohn组分Ⅳ沉淀溶解浓缩、PEG沉淀、一次病毒灭活、一次超滤浓缩、三次层析精制、冻干、二次病毒灭活，最终得到α1‑抗胰蛋白酶。本发明专利技术的方法以低温乙醇法生产白蛋白的废弃物——Cohn组分Ⅳ沉淀为起始原料制备AAT，有利于提高原料血浆的综合利用率。整个方法过程中采用PEG沉淀结合阴离子交换层析、两次蓝色染料亲和层析，可有效去除杂质蛋白，最终获得纯度大于95％的AAT制剂，比活大于3900U/mg。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白纯化
，特别是涉及一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1-抗胰蛋白酶的方法。
技术介绍
α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，AAT)是由394个氨基酸及3条寡糖侧链构成的单链糖蛋白，分子量为52kDa，等电点为4.8，活性位点位于358～359位的Met-Ser区域。70～80％的AAT由肝细胞合成分泌，此外，单核细胞、巨噬细胞、肺泡细胞也能产生少量的AAT。AAT主要的生理功能为维持蛋白酶-抗蛋白酶系统的平衡，保护正常组织不受酶解损伤。正常人血浆中AAT的浓度为1.0～2.0mg/ml，低于0.5mg/ml时，则很难抵抗中性粒细胞脱颗粒释放的弹性蛋白酶(neutrophilelastase，NE)，NE可降解肺泡结缔组织中的弹性纤维，任其发展将会导致肺气肿，慢性阻塞性肺疾病。AAT缺乏为常染色体显性遗传病，由瑞典医生Laurell和Eriksso在1963年发现，并将其命名为AAT缺乏症(alpha-1antitrypsindefiency，AATD)。常见的突变体为S型和Z型，Z型AAT还会形成多聚体，聚集在肝细胞的内质网上，最终引发肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。临床上采用外源性AAT补充疗法以纠正AAT-NE的失衡，静脉输注AAT(60mg/kg/week)可使血浆中AAT的水平达到保护阈值，血清抗NE能力明显提高。近年来，越来越多的研究表明AAT不仅是一种蛋白酶抑制剂，还能调节免疫、控制炎症及病原微生物感染。其中，对于AAT通过抑制炎症反应，延缓I型糖尿病发展、减少移植胰岛死亡数量的研究已进入临床试验阶段。1987年，FDA批准了第一个血浆来源的AAT冻干制剂(Prolastin)上市，用于治疗先天性AAT缺乏的肺气肿患者。目前，共有6种AAT产品(Prolastin，Aralast，Zemaira，Prolastin-C，AralastNP，Glassia)在售。上述AAT产品以低温乙醇法生产白蛋白的废弃物——CohnFraction(Cohn组分)Ⅳ沉淀为起始原料进行制备，除Zemaira外，其它5种AAT产品均先采用聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)沉淀法或PEG结合ZnCl2沉淀法粗纯；再由阴离子交换层析或阴、阳离子交换层析精制；巴氏病毒灭活法、纳米膜过滤、S/D法有效灭活或去除病毒，保证制品临床使用的安全性。其中，Prolastin制备工艺的原型为CoanMH等人在1985年公布的纯化方法(Preparationandpropertiesofalpha1-proteinaseinhibitorconcentratefromhumanplasma.VoxSang.1985；48(6):333-42.)，该方法将Cohn组分Ⅳ-1沉淀重悬在pH8.2的Tris-HCl缓冲液中，采用PEG3350分级沉淀法结合DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换层析制备AAT。CoanMH等人在已公布的专利(US4379087，US4439358)中选用分子量为3000-4000的PEG为沉淀剂，PEG的用量随溶液pH值的升高而增加。经PEG沉淀后杂蛋白被去除，AAT保留在上清中，阴离子交换层析可选择性洗脱AAT。上述纯化工艺以蔗糖和柠檬酸钠为保护剂进行巴氏病毒灭活，AAT终产品的纯度为60％。上述纯化工艺得到的产品纯度不高，且只包括一步病毒灭活工艺，无法保证终产品临床使用的安全性。LebingW等公开的专利(US6462180)中将PEG沉淀法与阴阳离子交换层析结合可提高AAT的纯度，结合在阴离子交换层析上的AAT被选择性洗脱下来，通过调节pH值和电导可使AAT保留在阳离子交换层析的穿透峰中，最后采用去污剂(Tween20)、纳米膜过滤进行病毒灭活处理，AAT终产品的纯度为95％。专利申请CN102993298A中表明采用PEG沉淀法结合阴阳离子交换层析，病毒灭活工艺为S/D法和15nm膜过滤，可获得纯度为99-100％的AAT制剂(醋酸纤维膜电泳得到的纯度)。专利申请CN102180966A中显示Cohn组分Ⅳ-1沉淀溶解液先后进行冷乙醇沉淀，S/D法病毒灭活，PEG沉淀，两步阴离子交换层析，巴氏病毒灭活，最终得到纯度为96-99％的AAT终产品。以上纯化工艺均采用离子交换层析精制AAT，然而离子交换层析是利用蛋白在不同pH值条件下带电荷数不同，与层析介质的结合存在差异而进行分离的。蛋白的带电荷数归根结底取决于等电点的大小，白蛋白的等电点为4.7～4.9，与AAT(4.8)接近，因此，采用离子交换层析很难去除在Cohn组分Ⅳ沉淀中含量很高的白蛋白，严重影响AAT的纯度和比活。此外，SDS-PAGE图谱显示白蛋白与AAT的电泳位置接近(图3)，这使得含有白蛋白的AAT样品在进行SDS-PAGE分析时呈现一条蛋白带，图3中a泳道的样品为经纯化后的AAT混入20％的人血白蛋白，该样品与对照品AAT在电泳图上的位置基本相同，这也是上述纯化工艺很难去除白蛋白，却获得较高纯度的原因，也就是说三种纯化工艺得到的AAT测得的纯度并不准确。朱威等发表文章(α1-抗胰蛋白酶制剂的制备及其病毒灭活，中国生物制品学杂志，2001，14(2)：97-101)对Cohn组分Ⅳ沉淀抽提液进行PEG、有机溶剂、等电点沉淀，通过阴离子交换层析及凝胶过滤获得了纯度为91.3±1.52％的AAT制剂，纯化倍数约27.42倍，巴氏病毒灭活法可有效灭活病毒。以下两项专利(CN101274956A，CN101747432A)提供的AAT制备方法同样采用阴离子交换层析及凝胶过滤精制AAT，病毒灭活方法分别为巴氏病毒灭活法结合干热法，S/D法结合D20纳米膜过滤。上述方法中均采用凝胶过滤纯化AAT，但是凝胶过滤是根据蛋白分子量大小进行分离的，白蛋白的分子量为66.5kDa，仍与AAT接近(52kDa)，因此，采用凝胶过滤仍然很难去除白蛋白。TravisJ等发表文章(Selectiveremovalofalbuminfromplasmabyaffinitychromatography.ClinChimActa.1973Nov23；49(1):49-52.)发现一种蓝色染料GibacronBlueF3GA可与白蛋白结合，将其偶联在琼脂糖上能去除血浆中96％的白蛋白，且不损失其他蛋白。PannellR等发表文章(Isolationandpropertiesofhumanplasmaalpha-1-proteinaseinhibitor.Biochemistry.1974Dec17；13(26):5439-45.)采用Sepharose-BlueDextran吸附白蛋白，结合硫酸铵沉淀、两步阴离子交换层析从全血中提取AAT。余健等发表文章(蓝琼脂糖珠在纯化人血清α1抗胰蛋白酶中的应用，中国生物化学与分子生物学报，1991，7(1):122-4.)采用一步硫酸铵沉淀粗纯，四步层析(蓝琼脂糖珠亲和层析、DEAE纤维素柱层析、ConA琼脂糖珠亲和层析、SephacrylS-200凝胶过滤)精制AAT。上述AAT纯化方法引入亲和层析虽能有效去除白蛋白，但制备方法繁本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1‑抗胰蛋白酶的方法，其特征在于，将Cohn组分Ⅳ沉淀依次经过溶解浓缩、PEG沉淀、一次病毒灭活、一次超滤浓缩、三次层析精制、冻干、二次病毒灭活，最终得到α1‑抗胰蛋白酶(AAT)。

【技术特征摘要】
1.一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于，将Cohn组分Ⅳ沉淀依次经过溶解浓缩、PEG沉淀、一次病毒灭活、一次超滤浓缩、三次层析精制、冻干、二次病毒灭活，最终得到α1-抗胰蛋白酶(AAT)。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述三次层析精制为一次阴离子交换层析精制和两次蓝色染料亲和层析精制。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，用所述阴离子交换层析精制中洗脱AAT的AAT洗脱液平衡蓝色染料亲和层析精制中的蓝色染料亲和层析柱，及用来洗脱AAT；优选的，用阴离子交换层析精制中平衡阴离子交换层析柱的平衡液洗脱去除未结合在柱上的转铁蛋白和白蛋白。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述AAT洗脱液为含45-65mMNaCl的pH5.0-5.4、10-50mM醋酸盐缓冲液；优选的，所述平衡液为pH5.0-5.4、10-50mM醋酸盐缓冲液。5.根据权利要求2-4任一所述方法，其特征在于，所述阴离子交换层析精制中首先用平衡液平衡阴离子交换层析柱，然后上样，之后先用同一平衡液冲洗阴离子交换层析柱以去除未结合在柱上的转铁蛋白和白蛋白，再用pH4.6-4.8、10-50mM醋酸盐缓冲液洗脱结合在柱上的白蛋白和维生素D结合蛋白，最后用AAT洗脱液洗脱AAT，得到AAT洗脱样品，整个纯化过程的流速为150-350cm/h；阴离子交换层析柱的介质优选离子交换基团为二乙基氨基乙基(diethylaminoethyl，DEAE)的弱阴离子交换层析介质或离子交换基团为季胺基(quaternaryammoniumgroup，Q)的强阴离子交换层析介质。6.根据权利要求2-5任一所述方法，其特征在于，所述蓝色染料亲和层析精制中首先用所述AAT洗脱液平衡蓝色染料亲和层析柱，然后上样，之后用所述AAT洗脱液冲洗蓝色染料亲和层析柱以去除未与蓝色染料结合的AAT，得到AAT穿透样品，整个纯化过程的流速为70-120cm/h；蓝色染料亲和层析柱的介质优选亲和配基为蓝色染料的亲和层析介质，如BlueSepharose6FastFlow；优选的，两次所述蓝色染料亲和层析精制中二次蓝色染料亲和层析与一次蓝色染料亲和层析的柱体积比为1:(15-20)。7.根据权利要求2-6任一所述方法，其特征在于，两次蓝色染料亲和层析精制可使用同一蓝色染料亲和层析柱；具体为：一次蓝色染料亲和层析结束后，用过的蓝色染料亲和层析柱用含0.5-1.0MKSCN的pH5.0-8.5、10-50mM醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗脱结合在柱上的大分子(分子量＞180kDa)杂蛋白、转铁蛋白、白蛋白、维生素D结合蛋白。8.根据权利要求1-7任一所述方法，其特征在于，所述一次病毒灭活中将PEG沉淀所得上清液的pH值调节至6.5-7.5，0.22μm滤膜过滤，加入磷酸三正丁酯和吐温-80使其终浓度分别为0.3％(w/v，g/100mL)、1％(w/v，g/100mL)，23-25℃恒温水浴6h进行S/D法病毒灭活处理，得到灭活上清液。9.根据权利要求1-8任一所述方法，其特征在于，所述二次病毒灭活中将冻干所得AAT冻干品在99-100℃的水浴中进行干热法病毒灭活处理30min以灭活囊膜病毒和非囊膜病毒，得到最终的α1-抗胰蛋白酶。10.根据权利要求1-9任一所述方法，其特征在于，具体包括以下步骤：a)、Cohn组分Ⅳ沉淀溶解、浓缩：Cohn组分Ⅳ沉淀用8-10倍重量的水溶解，0-10℃搅拌2-4h，调节pH值至7.5-8.0，固液...

【专利技术属性】
技术研发人员：章金刚，张晋超，赵雄，吕茂民，马玉媛，皇甫超济，贾俊婷，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11