人α1抗胰蛋白酶制品的病毒灭活方法技术

本发明专利技术涉及一种人α1抗胰蛋白酶制品的病毒灭活方法，其包含以下步骤：1)将人α1抗胰蛋白酶以巴氏消毒法进行处理；2)将步骤1)所得人α1抗胰蛋白酶进行超滤除菌过滤和分装，然后进行冻干处理；3)将步骤2)所得冻干后人α1抗胰蛋白酶进行终端干热灭活处理；其中，步骤3)中的干热灭活处理的温度为100℃±2℃，灭活时间为60‑90分钟。本发明专利技术的方法操作简单、成本低、易于推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制品生物
，具体公开一种人α1抗胰蛋白酶的病毒灭活方法。
技术介绍
人α1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1AT或AAT)，是机体内的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有蛋白酶抑制作用的一种急性时相反应蛋白，分子量为53KDa，PI范围为4.7-5.0，血浆中含量约为2g/L,占蛋白质总量的3％-4％，是一种糖蛋白，含有10％-12％糖。血源性AAT的制备，主要从血浆或低温乙醇的组分Ⅳ沉淀开始，经过复溶、PEG沉淀、离子交换层析等分离纯化步骤制得冻干制品。血液制品安全性的要求不断提高，目前，血液制品需要2种及以上的病毒灭活方法和步骤，以保证制品安全，血液制品常用的病毒灭活方法主要采用S/D法、巴氏法和纳米膜过滤法等。S/D法是去除包膜病毒的有效方法。但是采用S/D方法后需要增加去除S/D步骤。纳米膜过滤法对包膜和非包膜病毒都有效果，纳米膜过滤的透过速度与蛋白浓度成反比，纳米膜过滤前后目标蛋白的生物学活性，结构和稳定性等并无明显变化，20nm滤膜比35nm滤膜孔径更严苛，病毒去除效果更佳,但是纳米膜过滤成本高昂。本专利技术使用的人α1抗胰蛋白酶原料已经经过巴氏法处理，巴氏法有效去除包膜病毒的有效方法。终端干热法作为第二种病毒灭活方法，是将制品分装至终容器冻干后，进行的加热灭活。干热后制品外观呈乳白色或淡黄色疏松体，易复溶，而且干热过程可以有效灭活细小病毒。
技术实现思路
为了克服上述技术问题，本专利技术公开了一种操作简单，成本低廉的终端病毒灭活方法在应用于人α1抗胰蛋白酶制品，可以取得良好的病毒灭活效果。专利技术人发现100℃90分钟终端干热法可以灭活人α1抗胰蛋白酶制品中的指示病毒>4LgTCID50/0.1ml。本专利技术一个方面提供了一种人α1抗胰蛋白酶制品的病毒灭活方法，其包含以下步骤：1)将人α1抗胰蛋白酶以巴氏消毒法进行处理；然后经过超滤透析将人α1
抗胰蛋白酶浓缩至终浓度2)将步骤1)所得人α1抗胰蛋白酶进行除菌过滤和分装，然后进行冻干处理；3)将步骤2)所得冻干后人α1抗胰蛋白酶进行终端干热灭活处理；其中，步骤3)中的干热灭活处理的温度为100℃±2℃，灭活时间为60-90分钟。其中，步骤2)中冻干所使用的冻干保护剂为氯化钠、甘露醇、磷酸盐、甘氨酸等氨基酸和或其它氨基酸盐酸盐。其中，步骤2)中冻干程序为预冻、退火、预冻、一次升华、二次升华。其中，步骤3)中干热灭活的温度为100℃±2℃，灭活时间为90分钟。其中，灭活的指示病毒选自细小病毒。其中，处理步骤不包含纳米膜过滤法或S/D法的步骤。其中，最终使得加入到人α1抗胰蛋白酶制品中的指示病毒滴度灭活值不低于4LgTCID50/0.1ml。本专利技术另一个方面提供了上述方法获得的人α1抗胰蛋白酶制品。有益效果血液制品的制备工艺至少应该包括两步病毒灭活步骤，人α1抗胰蛋白酶的病毒灭活方法主要采用巴氏法和纳米膜过滤法，虽然纳米膜过滤法是目前最有效的病毒去除方法，可以有效去除截留孔径以上的脂包膜和非脂包膜病毒，但因其价格昂贵应用受限。而巴氏法已为较为成熟的病毒灭活方法广泛用于人血白蛋白等生物制品，且经过多年的临床试验表明，巴氏法作为病毒灭活方法，其安全性已经得以证明。S/D法采用离子表面活性剂和去污剂，需要后续纯化步骤将其去除，以避免对人体的危害。本专利技术创造性的采用终端干热法作为人α1抗胰蛋白酶的病毒灭活方法之一。该方法具有以下优点：1.为终端容器灭活，是将制品冻干后，进行的加热灭活，灭活后即为成品，无后续纯化步骤，降低无菌风险。2.成本低，易于推广。3.方法操作简单，易于批量放大及工业化生产，应用前景乐观。具体实施方式实施例11、制备得到的冻干前的人α1抗胰蛋白酶样品，以巴氏法进行处理。2、按样品：病毒溶液为9:1(v:v)的比例加入指示病毒(猪细小病毒PPV)，分装为10ml/瓶留取冻干前样品取2瓶立即放置-80℃保存，即为原点样品。其余样品进行冻干。冻干完成后留取冻干后样品，为阳性对照样，其余样品进行100℃
±2℃终端干热灭活处理90分钟，为实验组样品。3、将每个冻干和灭活后样品用灭菌注射用水复溶待检，原点样品从-80℃取出，室温融化待检。测定每个样品中的残余病毒滴度。表1.终端干热法灭活人α1-抗胰蛋白酶制品中PPV结果试验结果表明：终端干热法可以分别有效灭活人α1-抗胰蛋白酶制品中PPV≥4.17LgTCID50/0.1ml。实验例21、制备得到的冻干前的人α1抗胰蛋白酶样品，以巴氏法进行处理。2、按样品：病毒溶液为9:1(v:v)的比例加入指示病毒(猪细小病毒PPV)，分装为10ml/瓶留取冻干前样品取2瓶立即放置-80℃保存，即为原点样品。其余样品进行冻干。冻干完成后留取冻干后样品，为阳性对照样，其余样品进行100℃±2℃终端干热灭活处理90分钟，为实验组样品。3、将每个冻干和灭活后样品用灭菌注射用水复溶待检，原点样品从-80℃取出，室温融化待检。测定每个样品中的残余病毒滴度。表2.终端干热法灭活人α1-抗胰蛋白酶制品中PPV结果试验结果表明：终端干热法可以分别有效灭活人α1-抗胰蛋白酶制品中PPV≥4.07LgTCID50/0.1ml。实验例31、制备得到的冻干前的人α1抗胰蛋白酶样品，以巴氏法进行处理。2、按样品：病毒溶液为9:1(v:v)的比例加入指示病毒(猪细小病毒PPV)，分装到终容器中，分装为10ml/瓶，留取冻干前样品取2瓶立即放置-80℃保存，即为原点样品。其余样品进行冻干。冻干完成后留取冻干后样品，为阳性对照样，其余样品进行100℃±2℃终端干热灭活处理90分钟，为实验组样品。3、将每个冻干和灭活后样品用灭菌注射用水复溶待检，原点样品从-80℃取出，室温融化待检。测定每个样品中的残余病毒滴度。表3.终端干热法灭活人α1-抗胰蛋白酶制品中PPV结果试验结果表明：终端干热法可以有效灭活人α1-抗胰蛋白酶制品中PPV≥4.7LgTCID50/0.1ml。实验例41、制备得到的冻干前的人α1抗胰蛋白酶样品，冻干后效价为31.4。2、采用实施例1-3的方法制备用灭菌注射用水复溶待检，原点样品从-80℃取出，室温融化待检。测定每个样品中的残余病毒滴度，测定不含病毒样品的效价。实验结果显示：本专利技术人α1抗胰蛋白酶冻干保护剂对目的蛋白的活性保护效果好。且可以有效灭活加入制品中的非包膜指示病毒(猪细小病毒)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人α1抗胰蛋白酶制品的病毒灭活方法，其包含以下步骤：1)将人α1抗胰蛋白酶以巴氏消毒法进行处理，然后经过超滤透析将人α1抗胰蛋白酶浓缩至终浓度；2)将步骤1)所得人α1抗胰蛋白酶进行分装，然后进行冻干处理；3)将步骤2)所得冻干后人α1抗胰蛋白酶进行终端干热灭活处理；其中，步骤3)中的干热灭活处理的温度为100℃±2℃，灭活时间为45‑180分钟(优选为60‑90分钟)。

【技术特征摘要】
1.一种人α1抗胰蛋白酶制品的病毒灭活方法，其包含以下步骤：1)将人α1抗胰蛋白酶以巴氏消毒法进行处理，然后经过超滤透析将人α1抗胰蛋白酶浓缩至终浓度；2)将步骤1)所得人α1抗胰蛋白酶进行分装，然后进行冻干处理；3)将步骤2)所得冻干后人α1抗胰蛋白酶进行终端干热灭活处理；其中，步骤3)中的干热灭活处理的温度为100℃±2℃，灭活时间为45-180分钟(优选为60-90分钟)。2.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：李陶敬，邹莉，彭焱，周雁翔，周志军，林连珍，胡勇，邢延涛，邓志军，李娟，陈克金，詹骞，岳胜兰，李策生，
申请(专利权)人：武汉生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42