猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白及其应用，尤其涉及猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白作为猪囊尾蚴病检测抗原的应用和猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白在制备猪囊尾蚴病检测试剂盒中的应用。本发明专利技术的猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白能够特异性诊断猪囊尾蚴病，而与猪细颈囊尾蚴、旋毛虫等寄生虫病无任何交叉反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白及其应用，尤其涉及TsSerpin B6重组蛋白作为猪囊尾蚴检测抗原的应用和TsSerpin B6重组蛋白在制备猪囊尾蚴病检测试剂盒中的应用。
技术介绍
囊虫病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)幼虫寄生在人和猪的皮下、肌肉和脑等部位引起的一种食源性的人兽共患寄生虫病。该病不但对养猪业造成巨大经济损失，而且严重威胁着食品安全和人类健康。研究发现，丝氨酸蛋白酶抑制剂在蠕虫寄生宿主免疫调节中扮演着重要角色，病原体的丝氨酸蛋白酶抑制剂通过干扰宿主免疫调节信号来抑制宿主免疫系统的激活。因此，研究猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的免疫调节功能，无疑将为阐明猪带绦虫在感染宿主过程中的免疫逃避机制和探索新的诊断和疫苗抗原具有指导意义。丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)是一类重要的结构相似、功能多样的球状蛋白酶抑制剂超家族，真核生物、细菌、病毒、古细菌中都发现存在serpin基因。Serpins参与很多重要的生理活动，例如信号传导，血凝、纤维蛋白溶解、炎症反应以及补体激活等，在调节内源性蛋白酶和外源性蛋白酶中均发挥着重要作用。不仅如此，Serpins还在寄生虫入侵宿主过程中也发挥着重要作用。寄生蠕虫的Serpins通过抑制宿主丝氨酸蛋白酶活性，使其免受宿主体内蛋白水解酶类的降解，从而逃避宿主的免疫攻击。已有研究表明，从蛔虫、钩虫等寄生虫分离的丝氨酸蛋白酶抑制剂可抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶等肠道消化酶活性。埃及血吸虫通过虫体表面丝氨酸蛋白酶抑制剂因子与人的胰蛋白酶相结合来降低自身的免疫原性，从而逃脱宿主的免疫攻击。Merckelbach等在多房棘球绦虫发现经原核表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂能抑制胰蛋白酶，糜蛋白酶及弹性蛋白酶活性，推测多房棘球绦虫能够抵抗宿主肠道消化酶对虫体的损伤，以此逃避宿主的免疫攻击。因此，Serpin有望成为重要的疫苗和诊断抗原候选分子。开展猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的相关研究将有助于
阐明猪带绦虫免疫逃避机制，为研发新型疫苗、诊断制剂和药物提供理论基础。
技术实现思路
为了解决现有猪囊尾蚴病诊断技术中存在的交叉反应问题，本专利技术提供了猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白及其应用，尤其涉及TsSerpin B6重组蛋白作为猪带绦虫/囊尾蚴检测抗原的应用和TsSerpin B6重组蛋白在制备猪囊尾蚴病检测试剂盒中的应用。本专利技术提供猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白，所述猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。本专利技术还提供猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白作为猪带绦虫/囊尾蚴检测抗原的应用；所述猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。本专利技术还提供猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白在制备猪囊尾蚴病检测试剂盒中的应用；所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。本专利技术还提供一种猪囊尾蚴病ELISA检测试剂盒，所述试剂盒中包被抗原为猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。作为优选，所述试剂盒中还包括HRP标记的兔抗猪IgG。本专利技术还提供一种猪带绦虫ELISA检测方法，所述方法不以专利法规定的疾病的诊断和治疗为目的，以纯化的TsSerpin B6重组蛋白1μg于37℃包被酶标反应板1h，封闭液为1％BSA，用PBST充分洗涤后分别加入待测样品和猪阴性血清，37℃孵育1h，PBST洗涤三次后，加入1:5000倍稀释的HRP标记的兔抗猪IgG，充分洗涤后再加入DAB显色，用浓硫酸终止反应后测定吸光度，P(阳性)/N(阴性)>2时，为阳性血清，反之，为阴性血清。本专利技术利用猪带绦虫基因组和转录组数据设计TsSerpin B6特异引物，以猪囊尾蚴总RNA为模板，RT-PCR扩增TsSerpin B6基因，并通过生物信息学分析进行鉴定。构建pET-30a-TsSerpin B6重组表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果为：TsSerpin B6的ORF由1131个核苷酸组成，编码376个氨基酸残基；其编码氨基酸具有Serpins较为保守的反应中心环
(RCL)和特征性结构域，并且存在9个潜在的线性B淋巴细胞抗原表位。TsSerpin B6的表达产物主要以包涵体形式存在，且可与猪囊尾蚴阳性血清发生反应，在53kDa处产生特异条带。以纯化的TsSerpin B6重组蛋白1μg作为间接ELISA的诊断抗原，可特异性检测猪囊尾蚴阳性血清，而与猪细颈囊尾蚴、猪旋毛虫、弓形虫无任何交叉反应。结论：所克隆的片段即为TsSerpin B6，其表达产物可作为猪囊尾蚴病ELISA诊断的特异性抗原。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为猪囊尾蚴的SerpinB6基因的PCR扩增结果；其中，M:DNA分子质量标准；1.SerpinB6；图2为TsSerpin B6的三级结构预测；图3为TsSerpin B6部分序列与其他寄生虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列对比；图4为不同物种Serpins的系统进化分析；图5为TsSerpin B6融合蛋白纯化结果；其中，M:蛋白质分子质量标准；1：50mM咪唑；2：200mM咪唑；3：300mM咪唑；4：400mM咪唑；5:500mM咪唑；图6为TsSerpin B6融合蛋白Western-blotting结果，其中，M:蛋白质分子质量标准；1:猪阴性血清；2：猪阳性血清。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。实施例11 材料与方法1.1 虫株与血清猪囊尾蚴、猪囊尾蚴阳性和阴性血清均由中国农业科学院兰州兽医研究所蠕虫病课题组保存。1.2 试剂质粒小量提取试剂盒、TRIzol Reagent、DNA胶回收试剂盒、pMD-T-19(simple)Vector、限制性内切酶BamH I、Hind III、T4DNA连接酶、均购自Takara公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒、Prestained Protein Ladder均购自Thermo公司；大肠杆菌感受态细胞、pET-30a、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、X-Gal、5×蛋白上样缓冲液均购自北京全式金生物技术有限公司；兔抗猪IgG(HRP)购自Sigma公司；Ni Sepharose 6Fast Flow蛋白纯化试剂盒购自GE公司。1.3 总RNA的提取及cDNA合成用TRIzol法提取猪带绦虫囊尾蚴的总RNA，以Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA第一链。1.4 引物设计合成根据本课题组完成的猪带绦虫全基因组测序注释信息及转录组分本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。

【技术特征摘要】
1.猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。2.猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白作为猪带绦虫/囊尾蚴检测抗原的应用；所述猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。3.猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白在制备猪囊尾蚴病检测试剂盒中的应用；所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。4.一种猪囊尾蚴病ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包被抗原为猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表S...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆学农，刘光学，梁盼红，张少华，侯俊玲，郭爱疆，郑亚东，才学鹏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62