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一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因及其医用用途制造技术

技术编号:12295821 阅读:71 留言:0更新日期:2015-11-11 07:40
本发明专利技术提供了一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因,本发明专利技术还涉及利用该诊断基因蛋白制备单克隆抗体和多克隆抗体,可用于建立犬细粒棘球绦虫粪抗原的检测方法,进一步讲是提供了用于犬的细粒棘球绦虫ELISA检测的蛋白基因,并应用于犬细粒棘球绦虫双抗夹心ELISA方法的建立中,属于犬科动物疾病检测技术领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因,此外,本专利技术还涉及利用该诊断基因蛋白制备单克隆抗体和多克隆抗体,可用于建立犬细粒棘球绦虫粪抗原的检测方法,进一步讲是提供了用于犬的细粒棘球绦虫ELISA检测的蛋白基因,并应用于犬细粒棘球绦虫双抗夹心ELISA方法的建立中,属于犬科动物疾病检测

技术介绍
犬细粒棘球绦虫病是细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)成虫寄生于犬的小肠内,使患犬食欲减退、消化紊乱,导致消化系统遭受严重损伤的一种寄生虫病。其虫卵或者节片可随犬粪排出体外,感染牛、羊、猪等动物以及人。至今,犬细粒棘球绦虫病已在世界范围内流行,尤其是牧业国家。已严重威胁人类健康和畜牧业的快速发展,给世界经济造成了严重的损失。犬是细粒棘球绦虫的主要终末宿主,也是细粒棘球蚴病的重要传染源。因此对犬感染该虫情况的动态监测、诊断并及时治疗对预防和彻底根除细粒棘球绦虫病具有重大的意义。目前,细粒棘球绦虫成虫诊断抗原包括成虫虫体粗提抗原、囊液抗原、原头节虫体抗原及其分泌物抗原等许多种类。用于诊断的成虫粗抗原虽然敏感性较高,但是特异性很低。纯化后的抗原虽然特异性较粗提抗原高,但是敏感性同时也降低了。有些抗原又具有时限性,有些抗原处理与制备操作复杂。对于重组抗原,应用于诊断领域的主要为Ag5和AgB,但其常与其他寄生虫发生交叉反应。因此目前还有针对犬细粒棘球绦虫诊断的金标准抗原。粪抗原的检测方法主要有槟榔碱导泻法、ELISA方法、PCR方法等,但是槟榔碱导泻法的反应率具有一定的局限性;ELISA方法常出现敏感性低,并伴有一定的交叉反应;PCR方法常出现假阳性,并对仪器要求较高。至今也没有检测犬细粒棘球绦虫的金标准方法。因此,选择高特异性的抗原,建立具有高敏感性、高特异性的犬细粒棘球绦虫粪抗原的诊断方法十分必要。
技术实现思路
:本专利技术公开了一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因,采用细粒棘球绦虫兔高免血清对本实验室保存的细粒棘球绦虫cDNA文库进行相关抗原筛选,筛选出具有价值开放性阅读框的基因。本专利技术所述的一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因,如SEQIDNO1所示。该序列具有864bp的开放性阅读框,编码288个氨基酸,基因序列经NCBIBLAST氨基酸同源性分析与多房棘球绦虫诊断抗原gp50(Echinococcusmultilocularisdiagnosticantigengp50)的氨基酸序列(CDJ06164.1)有92%同源性,是一个未知的新基因,命名为:EdiagA864。对本专利技术基因的编码蛋白经Sopma在线分析预测二级结构,其α-螺旋占10.07%,延伸链占33.33%,无规则卷曲占56.60%。延伸链和无规则卷曲共占89.93%;CBS在线预测TMHMM跨膜结构分析,该基因编码蛋白为胞外蛋白;该蛋白具有含有B细胞表位的结构基础。经CBSPredictionServersLinearB-cellepitopes预测分析及DNAMAN亲水性及疏水性分析,为构建有效的疫苗或诊断方法奠定基础,也为制备单克隆抗体与多克隆抗体提供高特异性的抗原,建立了快速、特异性的检出犬细粒棘球绦虫粪抗原的双抗夹心ELISA检测方法,对犬细粒棘球绦虫的防治提供新的依据或工具。本专利技术还提供了该基因蛋白的原核表达载体,其特征在于:通过PCR方法扩增编号为EdiagA864的目的基因,其大小为864bp,回收该DNA后连接pMD-18T克隆载体,载体构建完成后经双酶切鉴定及测序比对后确定该基因的克隆载体构建成功后,再将该基因与pET-32a载体连接,成功构建表达载体。表达载体转入Transetta(DE3)大肠杆菌感受态后,诱导其表达可得到51kDa左右的蛋白条带,经WesternBlot检测分析其具有良好的反应原性,为研制犬细粒棘球绦虫成虫的诊断抗原或疫苗奠定了基础。本专利技术所述的一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因的制备方法,包括以下步骤:首先采用SEREX技术对细粒棘球绦虫cDNA文库进行相关抗原筛选。对文库λ噬菌体进行平板培养,去除交叉抗体反应后用IPTG诱导其表达,用兔抗细粒棘球绦虫成虫高免血清、HRP标记的羊抗兔IgG对所表达的蛋白进行阳性筛选。对其筛选出的阳性噬菌斑进行插入基因的克隆及分析,获得基因并命名。然后对其进行开放性阅读框PCR扩增,连接pMD-18T构建克隆载体,经双酶切鉴定及测序比对后确定该基因的克隆载体构建成功后,再将该基因与pET-32a载体连接,成功构建表达载体。表达载体转入Transetta(DE3)大肠杆菌感受态后,诱导其表达。最后对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳及WesternBlot检测分析其反应原性。本专利技术进一步提供了基于该基因蛋白的犬细粒棘球绦虫双抗夹心ELISA检测方法,用于检测犬科动物是否感染犬细粒棘球绦虫,解决了槟榔碱导泻法的反应局限性及危险性,检测血清特异性检测循环抗原及抗体等方法的不足,快速、特异性地检出犬细粒棘球绦虫的感染,适用于工业化生产。所用捕获抗体为利用在大肠杆菌E.coli(DE3)表达的EdiagA864蛋白作为抗原,经免疫、细胞融合获得了杂交瘤细胞株,经腹水收集纯化而得的单克隆抗体;所用抗体稀释液为pH值7.4的磷酸盐缓冲液;包被液为pH值9.6的碳酸盐缓冲液;封闭液为5%的脱脂奶粉PBST液;洗涤液为Tween-20含量为0.5%的0.01mol/L的pH值7.4的PBST溶液;终止液为2mol/LH2SO4溶液;酶标抗体为以重组蛋白EdiagA864为抗原,辣根过氧化物酶标记免疫后的兔多克隆抗体;底物溶液为pH值5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液和H2O2配置的邻苯二胺(OPD);样品稀释液为Tween-20含量为0.3%的0.01mol/L的pH值7.4的PBST溶液。本专利技术的积极效果在于:提供了一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因的编码蛋白,经Sopma分析其二级结构,具有含有B细胞表位的结构基础。经CBS在线预测TMHMM跨膜结构分析,该基因编码蛋白为胞外蛋白。大部分抗原决定簇都位于亲水区。以在大肠杆菌E.coli(DE3)表达的EdiagA864蛋白作为抗原,经免疫、细胞融合获得了杂交瘤细胞株,经腹水收集纯化而得了单克隆抗体;以EdiagA864重组蛋白为抗原,经辣根过氧化物酶标记,获得了酶标兔抗EdiagA864多克隆抗体,建立了检测犬细粒棘球绦虫的双抗体夹心ELISA方法。本专利技术采用单克隆抗体与多克隆抗体,增加了双单克隆抗体夹心ELISA的敏感性,减少了双多克隆抗体夹心ELISA反应的假阳性率。以该蛋白为基础建立的犬细粒棘球绦虫检测方法特异性高、敏感性强、重复性好。具有操作简单、检测快速,易于判断等优点,适合于临床的快速诊断和牧区、村镇等流行病学调查大规模应用。利用本专利技术的基因蛋白建立的双抗夹心ELISA可用于制备试剂盒,且所有试剂均为已配制好的工作液,可以直接操作无需处理,减少了操作步骤,可以快速,灵敏检测待检样品中的细粒棘球绦虫抗原,避免了复杂的操作,对设备要求低,可以适应多种检测环境;且样本用量小,采集方便,试剂保存本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因,如SEQ ID NO 1所示。

【技术特征摘要】
1.一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因,如SEQIDNO1所示。
2.权利要求1所述的一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因的制备方法,包括以下步骤:
首先采用SEREX技术对细粒棘球绦虫cDNA文库进行相关抗原筛选;
对文库λ噬菌体进行平板培养,去除交叉抗体反应后用IPTG诱导其表达,用兔抗细粒棘球绦虫成虫高免血清、HRP标记的羊抗兔IgG对所表达的蛋白进行阳性筛选;
对其筛选出的阳性噬菌斑进行插入基因的克隆及分析,获得基因并命名;
然后对其进行开放性阅读框PCR扩增,连接pMD-18T构建克隆载体,经双酶切鉴定及测序比对后确定该基因的克隆载体构建成功后,再将该基因与pET-...

【专利技术属性】
技术研发人员:张西臣刘原源李建华宫鹏涛王晓岑安红燕杨举李赫张楠尹继刚
申请(专利权)人:吉林大学
类型:发明
国别省市:吉林;22

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