本发明专利技术提供了一种新的物种特异表面蛋白，该基因全长1533bp DNA序列，共编码511个氨基酸残基，该基因可以用于微粒子病的免疫检测以及作为家蚕微粒子病防控新靶点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物
，具体涉及家蚕微粒子病特异检测的基因及其应 用。
技术介绍
家蚕微粒子病是由一种原虫引发的毁灭性病害，可通过食下传染或胚种传播。鉴 于该病害潜伏周期长、病程周期长、传播速度快、对外界的抵抗力强，因此，它是蚕桑业唯一 的法定检疫病害，并且主要依赖于传统的母蛾镜检法进行检疫。但是该方法随机性高、效率 性差、潜伏期长、人为误差相对较大，因此，寻找并鉴定出家蚕微粒子病特异的检测靶标是 高效、快速、特异的进行该病害防控的基础。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是为解决当前对家蚕微粒子病检疫方法随机性高、效率性差、 潜伏期长、人为误差相对较大的问题，提供了家蚕微粒子病特异检测靶标基因 NBOPl及其 在家蚕微粒子病的免疫检测以及作为家蚕微粒子病防控新靶点中的应用。 本专利技术通过比较基因组学分析、基因克隆、基因测序、免疫定位等技术，在家蚕微 孢子虫中获得了一种新的物种特异地表面蛋白，该基因被命名为NBOP1。该基因全长共计 1533bp DNA序列，共编码511个氨基酸残基，家蚕微粒子病特异检测靶标基因核苷酸序列 表如SEQ ID NO: 1所示。 本专利技术通过比较基因组学分析发现该基因为家蚕微孢子虫物种特异的一个新基 因；对基因的序列分析发现，该基因可能编码一个膜蛋白；基因表达实验，确定该基因定位 于家蚕微孢子虫的孢子壁；所以，该基因可以用于微粒子病的免疫检测以及作为家蚕微粒 子病防控新靶点。 本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种新的物种特异表面蛋白，该基因全长 1533bp DNA序列，共编码511个氨基酸残基，该基因可以用于微粒子病的免疫检测以及作 为家蚕微粒子病防控新靶点。【附图说明】 图1所示为NBOPl所在染色体片段与其他微孢子虫基因组共线性比较。 图2所示为该基因的疏水簇分析。 图3所示为不同地区微孢子虫分离株的形态观察图。 图中：上部为吉姆萨染色观察图，下部为电镜扫描观察图，A-广东株家蚕微孢子 虫，B-南阳柞蚕微孢子虫，C-山东株那卡属变形微孢子虫，D-重庆株家蚕微孢子虫。 图4多种家蚕病原微生物分离株的PCR检测图 图中：A-家蚕核型多角体病毒、B-家蚕微孢子虫广东株、C-柞蚕微孢子虫南阳株、 D-家蚕微孢子虫重庆株、E-那卡变形微孢子虫山东株、F-家蚕微孢子虫广西株。【具体实施方式】 下文将结合具体实施例详细描述本专利技术的内容。应当注意的是，下述实施例中描 述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到 更好的技术效果。 实施例1 在中国重庆家蚕微粒子病疫区采集得到被感染的家蚕，并分离得到家蚕微孢子 虫。对所得家蚕微孢子虫样品清洗，采用全基因组鸟枪法（Whole genome shot-gun, WGS) 进行家蚕微孢子虫全基因组测序。 1.材料与方法 1.1家蚕微孢子虫 家蚕微孢子虫CQl分离株，由西南大学蚕病室分离，并保存于中国兽医微生物菌 种保藏管理中心（CVCC)，保藏号CVCC102059。 1. 2小片段质粒文库的构建 通过极丝弹出法提取家蚕微孢子虫基因组DNA，通过HYDROSHEAR将微孢子虫基因 组DNA打断成小片段I. 5-2. 5Kb或7-8Kb，经过电泳分离收集，并与pUC18载体连接，转入 E. coli，铺板挑斑建库，并进行测序。 I. 3miniBAC 文库的构建 主要采用HindIII对制备好的高质量的基因组DNA进行不完全酶切， 收集 30-50Kbp 的片段，采用 Copy Control TM BAC Cloning Kits (EPICENTRE Biotechnologies.)进行建库。 L 4Solexa文库的构建 Solexa文库的建立主要参照Illumina公司的要求进行。简述如下，将溶于50 μ L 的2-5 μ g基因组DNA用压缩的氮气喷雾冲击打断，将片段处理成钝端后，加接头，再用2% 的琼脂糖凝胶分离收集150_250bp片段，并将收集到的片段用Illumina提供的引物扩增， 8~18个循环的反应产物被用来建库并进行测序。 1. 5基因组数据拼接、注释 所有的sanger reads和solexa reads都用于拼接。首先，solexa reads用深圳 华大研宄院的拼接软件进行拼接，将拼接的结果与Sanger Reads在混在一起，经NCBI NT 库过滤污染的细菌序列后，用PHRAP程序进行拼接。注释采用GLIMMER 3.0为主要程序，再 结合其它相关软件的分析结果进行。 1. 6重复序列的分类及分析 米用四种独立的软件ReAS、PILER-DF、RepeatScout和LTR_Finder进行家香微抱 子虫基因组序列中转座元件的预测，并根据已知各物种的重复序列对转座元件进行分类和 拷贝数统计。最终建立一个家蚕微孢子虫重复序列文库，并经手工检验。 2.结果与分析 基因组文库及相关测序、拼接及注释结果 为完成家蚕微孢子虫基因组测序，我们共建立了四种不同的文库，其中Sanger reads的测序深度共有7. 18倍，Solexa测序深度有28. 2倍，详细信息见表1。 表1各文库产出数据汇总 Table 2. I Summary of data production from four libraries 表2基因组拼接的统计结果 Table 2. 2 Statistics of genome assembly 如表2所示，经过拼接，获得3576重叠群（contigs)，利用reads的正反向关系， 可将2864个重叠群拼接成912Scaffolds,总长约13. 79Mb，scaffolds内部仍有1952个 "洞"(Gap)。最大的Scaffold长度为571275bp，大于400Kb的序列有4条，大于200Kb有11 条，大于IOOKb有31条，大于IOOKb以上的Scaffold总长为6. 715Mb。未拼接进scaffold的 contig有696个，总长约I. 95Mb。通过测序，获得家蚕微孢子虫全基因组数据共约15. 7Mb。 经过基因组注释，共获得4479个编码基因。重复序列的长度占基因组全长的 45.7%，在基因组中占有重要地位，而编码序列仅占基因组总长的21%，全基因组的GC% 为 30. 7%。 3、通过比较基因组学分析，通过基因共线性分析基因座位及基因排布的保守性， 与兔脑炎微孢子虫相比，筛选到139个家蚕微孢子虫特有的基因，其中NBOP1基因为家蚕微 抱子虫独有，而 Encephalitozoonromaleae, Encephalitozoonintestialis, Encephalitozo onhellem, Encephalitozoonbieneusi, Nosemaceranae, Vittaformacorneae, Edhazardiaae dis, Vavraiaculicisfloridensis, Trichomonashomonas, Nematocida spl 中缺失。石角定该 基因为家蚕微孢子虫物种特异基因。进一步并通过克隆测序分析，获得了该基因编码区的 全序列，基因全长共计1533bp，编码本文档来自技高网...
【技术保护点】
家蚕微粒子病特异检测靶标基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周泽扬，罗洁，潘国庆，杜孝田，
申请(专利权)人：罗洁，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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