家蚕成品卵中微粒子病病卵及病卵率的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种家蚕成品卵中微粒子病病卵的检测方法，其特征在于：首先提取待检家蚕成品卵内的总ＤＮＡ；根据家蚕微孢子虫基因的特异性序列，设计并合成一对特异性引物，二引物之间的间隔为０．５－２．０ｋｂ，以提取的待检家蚕成品卵内的总ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增，对扩增产物进行电泳检测，当检出家蚕微孢子虫的特异性基因片段时，判定该被检家蚕成品卵为微粒子病病卵。对家蚕成品卵进行集团检测，可以确定微粒子病的病卵率。本发明专利技术可以对家蚕成品卵直接进行检测，蚕卵无需催青至孵化，检测周期短，检测灵敏度高，能够满足用种单位的需求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物病害的检测方法，具体涉及一种家蚕的微粒子病的检测方法，尤其是家蚕的成品卵中微粒子病病卵率的分子生物学检测方法。
技术介绍
家蚕微粒子病是由微孢子虫感染所引起的一种传染性蚕病，该病具有胚种传染性，是蚕种生产中威胁最严重的传染性蚕病。为了制造无毒蚕种，减少胚种传染的危险，现有技术中，通常对母蛾进行检测。1870年，巴斯德首次提出了母蛾显微镜检验法，分别对每一母蛾进行检验，通过淘汰有毒母蛾所产蚕卵的方法杜绝胚种传染，该方法在蚕种生产实践中已应用了100多年，对家蚕微粒子病的控制起了不可估量的作用。然而，单蛾检验工作量大，时间紧，满足不了蚕种生产发展的要求。1968年，日本人提出了集团母蛾检验法(30蛾/集团)，根据概率学原理计算母蛾的带毒率，大大提高了检测效率，减轻了劳动强度，缩短了检测时间。1979年日本农林水产省编的《微粒子病检查指南》中规定病蛾率0.5％为危险率。80年代初，我国开始采用集团母蛾检验方法，1997年，农业部发布桑蚕一代杂交种检验规程(NY/T327-1997)，规定了母蛾检验操作规程和判别标准。然而，母蛾检验只是蚕种生产过程中的中间检验或者可称为过程检验，并不能正确反映蚕种的带毒率。一方面，蚕种的带毒率不仅与母蛾的带毒率有关，而且与母蛾的微粒子病的感染时期、发病时期、发病的严重程度、蚕品种有关，用母蛾带毒率表达蚕种的带毒率不够科学；另一方面，由于经济利益的驱动，采用过程检验方法，蚕种生产企业送检母蛾难以保证其代表性。因此，用种单位、蚕种检验部门要求进行成品卵检验的呼声越来越高。农业部在桑蚕一代杂交种检验规程(NY/T327-1997)中也颁布了家蚕成品卵检验的规定和判别标准，该规程规定1个检验集团为100粒左右蚕卵，采用显微镜镜检法，根据有无微孢子虫判别该集团是否带毒。然而，在实践中，该方法操作比较困难。在蚕卵中，微孢子虫的数量远低于母蛾中的数量，采用显微镜镜检法，其检出率远低于母蛾中微孢子虫的检出率，错判率高，并且，对检测人员的技术水平要求高。为解决这一问题，现有技术中，将蚕卵催青孵化，对蚁蚕进行检验，由此可以判定成品卵的带毒率。但这一过程通常需要10天左右，检验周期长，有时难以满足实际成产需要；同时，对蚁蚕进行显微镜镜检，通常只能检出孢子状态的微孢子虫，必须用特殊的染色方法，才能检出裂殖子状态的微孢子虫，因而实际操作中得出的成品卵带毒率并不准确。
技术实现思路
本专利技术的第一专利技术目的是提供一种检测灵敏度高、检测周期短的家蚕成品卵中微粒子病病卵的检测方法；本专利技术的第二专利技术目的是提供一种检测灵敏度高、检测周期短的家蚕成品卵中微粒子病病卵率的检测方法。为实现本专利技术的第一专利技术目的，采用的技术方案是一种家蚕成品卵中微粒子病病卵的检测方法，首先提取待检家蚕成品卵内的总DNA；根据家蚕微孢子虫的基因的特异性序列，设计并合成一对特异性引物，二引物之间的间隔为0.5-2.0kb，以提取的待检家蚕成品卵内的总DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，当检出家蚕微孢子虫的特异性基因片段时，判定待检家蚕成品卵为微粒子病病卵。上述技术方案中，与现有的显微镜镜检法主要依靠人工观测不同，采用的是分子生物学的检测方法，由于目前家蚕微孢子虫的许多基因序列片段均已明了，本领域的普通技术人员根据引物设计规律，即可设计、制备针对某一基因序列片段的特异性引物；当然，为保证检测结果的正确性，选定的微孢子虫的特异性引物，应当与蚕的DNA序列无特异性；同时，扩增片段的长度即特异引物间的间隔会影响到检测，选取特异引物间的间隔过短，难以用普通琼脂糖电泳法进行鉴别，必须采用复杂的电泳检测方法，例如聚丙烯凝胶电泳法，造成检测成本过大，选取特异引物间的距离过长，又会导致PCR扩增时所需时间过长，因此确定引物之间的间隔在0.5-2.0kb之间。上述技术方案中，对待检家蚕成品卵先进行预处理，所述预处理包括，用碱液处理15-30分钟，用水清洗，再用酸液中和，再用水清洗；所述总DNA的提取过程包括，在蚕卵中加入微孢子虫发芽诱导液，匀浆后常温下诱导0.5小时至2小时，再用发芽缓冲液处理至少20分钟，用蛋白酶K在37℃至50℃下消化蛋白质，抽提分离，再用RNA酶降解RNA，抽提去除RNA酶后，用无水乙醇沉淀DNA，并溶于水中；所述特异性引物长度在15-30bp，所述对扩增产物的检测方法采用琼脂糖凝胶电泳法。预处理的目的，一方面是使蚕卵的卵壳软化，以便于DNA的提取，另一方面可以使蚕自身的DNA发生降解，减少蚕自身DNA对PCR的干扰；由于微孢子虫在蚕卵中可处于孢子状态，其DNA的提取不便，易导致检测灵敏度降低，为解决这一问题，由微孢子虫发芽诱导液先进行诱导，再用发芽缓冲液处理，可促使微孢子虫发芽形成芽体，从而便于对其DNA的提取。对于蛋白酶K处理过后的抽提分离可用饱和酚、酚/氯仿的混合物、氯仿抽提；对RNA降解后的抽提通常采用酚/氯仿的混合物。为实现本专利技术的第二专利技术目的，采用的技术方案是一种家蚕成品卵中微粒子病病卵率的检测方法，包括下列步骤(1)蚕卵的预处理取80-120粒家蚕成品卵为一个集团，用碱液处理15-30分钟，用水清洗，再用酸液中和，再用水清洗；(2)DNA的提取在上述处理过的蚕卵中加入微孢子虫发芽诱导液，匀浆后常温下诱导0.5小时至2小时，再用发芽缓冲液处理至少20分钟，用蛋白酶K在37℃至50℃下消化蛋白质，抽提分离，再用RNA酶降解RNA，抽提去除RNA酶后，用无水乙醇沉淀DNA，并溶于水中；(3)PCR扩增根据家蚕微孢子虫的基因序列片段，选择制备对应的一对特异性引物，引物长度在15-30bp，2个引物间的间隔在0.5-2.0kb，用步骤2获取的DNA为模板，按常规方法进行PCR扩增；(4)进行琼脂糖凝胶电泳取上述PCR扩增后的产物，在含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶中进行电泳；(5)电泳结果判定电泳完成后，在紫外灯下观察琼脂糖胶，当观察到家蚕微孢子虫特异性的DNA条带时，认定该被检集团为阳性；(6)获取家蚕成品卵中微粒子病的病卵率对每一被检集团按上述步骤l至5进行检测，病卵率由下式确定， 式中，N为1个集团中蚕卵的粒数。上述技术方案中，所述预处理中的碱液为25-35％的氢氧化钾溶液；酸液为l摩尔/升的盐酸；在碱液和酸液处理后分别用水清洗。上述技术方案中，所述微孢子虫的发芽诱导液选自，0.1摩尔/升的碳酸钾与0.1摩尔/升的碳酸氢钾的混合物，0.2摩尔/升的氢氧化钟，或者是0.01摩尔/升的氢氧化钾与0.16摩尔/升的氯化钾的混合物；所述发芽缓冲液选自，0.01摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH值6.8-7.2)，或者pH值为8.0的TEK缓冲液(0.16摩尔/升的氯化钾，1毫摩尔/升的Tris-HCl，10毫摩尔/升的EDTA)。由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点1.由于本专利技术采用分子生物学方法，通过检测微孢子虫的基因序列实现对微粒子病病卵率的测定，可以对家蚕成品卵直接进行检测，蚕卵无需催青至孵化，检测周期短，能够满足用种单位的需求；2.本专利技术的检测灵敏度高，经实验证实，样品中只要有4个微孢子即可检出，300粒蚕卵中带有一粒有毒蚕卵也可检出3.本专利技术的蚕卵经过预处理后，蚕本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种家蚕成品卵中微粒子病病卵的检测方法，其特征在于：首先提取待检家蚕成品卵内的总ＤＮＡ；根据家蚕微孢子虫基因的特异性序列，设计并合成一对特异性引物，二引物之间的间隔为０．５－２．０ｋｂ，以提取的待检家蚕成品卵内的总ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增，对扩增产物进行电泳检测，当检出家蚕微孢子虫的特异性基因片段时，判定该被检家蚕成品卵为微粒子病病卵。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：贡成良，潘中华，郑小坚，沈卫德，曹广力，薛仁宇，陶维华，李掌林，陶鸣，潘丽芬，
申请(专利权)人：苏州大学，江苏省蚕种管理所，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]