本发明专利技术涉及一种利用转基因动物乳腺生物平台大规模生产重组单克隆抗体的方法。具体地，本发明专利技术提供了一种用于乳腺特异性表达的抗体元件构建物或表达盒，当所述构建物或表达盒整合入哺乳动物细胞后，经核移植使转基因哺乳动物乳腺表达并分泌所述的外源重组抗体蛋白，从而制得易于分离和纯化的单克隆抗体。本发明专利技术方法简单、高效，所产生的重组单克隆抗体能广泛应用于于诊断、预防、治疗癌症和许多其他重大疾病及免疫机制研究，尤其是恶性肿瘤治疗或自身免疫性疾病治疗领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药
，具体地涉及利用转基因动物乳腺生物平台大规模 生产重组单克隆抗体的方法。
技术介绍
过去的四十年中，生物制药技术发展非常迅速。生物药品具有疗效好，副作用小， 适应症广等优点，成为各种投资，尤其是大型制药公司投资研发的热点。生物药品的生产方 法可分为二大类，一是将特定的生物药物编码基因序列导入至工程菌或生物细胞中，经细 菌，酵母，或哺乳动物和人类细胞发酵培养，分离纯化而得到。微生物和酵母发酵培养只适 合于结构相对简单蛋白，如胰岛素和生长激素等培养生产，但对结构和翻译后修饰相对复 杂的蛋白，如单克隆抗体等的生产并不适用。哺乳动物和人类细胞培养能克服微生物和酵 母发酵的缺点，但早期投资成本高，风险较大，缺乏扩大或缩小规模灵活性，及消耗大量细 胞培养液体和耗材。这样就产生了第二种生产方法即转基因动物制药。该方法将药物蛋白 基因导入到动物体内，例如牛或山羊，然后使药物从乳腺或其它器官中生产出来，通过提纯 等工序制成生物药品。此法的特点是产量高，成本低，药物生物学活性稳定，高产量，高质 量，能耗低，无污染。近年来，由于基因工程技术的不断完善和动物克隆技术的专利技术，转基因 动物制药已成为研发非常活跃的领域。西方发达国家已有三十多年转基因动物制药开发历 史，技术已趋成熟。 自从Kohler和Milstein在1975年专利技术了一种制作单克隆抗体的新方法后，人们 开始意识到单克隆抗体在诊断、预防、治疗癌症和许多其他重大疾病及免疫机制研宄方面 的巨大潜力。1986年，美国FDA批准了第一个人类治疗用单克隆抗体，Murononab-3。目前 为止，共有约20多个单克隆抗体用于临床，还有200多个仍处于不同临床实验阶段。 最早的单克隆抗体是从免疫后的小鼠产生，如作为生物制剂应用于人体时，则因 是异性蛋白可引起过敏反应，严重时可发生肾功能衰竭，甚至危及生命。为克服此问题，研 宄人员将鼠源性负责抗原结合的抗体可变区与人源性抗体恒定区融合，所产生的嵌合型抗 体约70%属人源性，可减低人体免疫反应，但不能完全消除。新技术的发展使得单克隆抗体 鼠源性可变区部分更进一步降低，甚至几乎被人源性蛋白序列所替代。所产生的"人源性" 单克隆抗体含85-90%人类序列，但技术比产生嵌合型抗体更为复杂。此外，单克隆抗体人 源化有可能引起抗体失活。目前市场上大部分单克隆抗体药物属嵌合型或人源性抗体。 单克隆抗体还能通过噬菌体和酵母展示等技术获取。但噬菌体展示库只含单克隆 抗体片段，很少含抗体全序列片段。并且，抗体蛋白是通过低等动物细菌表达，活性较低。通 过酵母展示技术而筛选出的单克隆抗体或抗体片断，其翻译后修饰比细菌表达蛋白更接近 高等生物，但与人类还是不尽相同。另外，能用转基因动物产生治疗用人类基因源性单克隆 抗体。当应用抗原接种时，这些转基因动物如小鼠能产生全人源单克隆抗体，从而克服抗体 人源化的技术难题。但该技术受限于只能产生小鼠免疫系统可识别的单克隆抗体。 综上所述，现有技术中的各种系统或者不能生产或分离纯化足够数量具活性的人 源性单克隆抗体，这些治疗用单克隆抗体药物通常的市场总需求量达250-1000公斤，或者 所生产的具活性的人源性单克隆抗体产品不均一化，并且生产工艺复杂，造价昂贵。因此本 领域迫切需要开发新的稳定、高效、简便、经济、适合大规模生产和应用的制备单克隆抗体 的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种高效、简便、适合大规模生产和应用的制备单克隆抗 体的方法。 本专利技术的第一方面，提供了一种用于乳腺特异表达的供体构建物，其特征在于，所 述构建物从5'至3'，依次包括可操作性连接的式I中所示的元件： Al-Bl-Cl-Dl-E-Fl (式 I) 式中， ⑴Al为5'同源臂序列，所述5'同源臂序列选自哺乳动物乳腺特异表达蛋白基 因组序列，所述的哺乳动物乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白（WAP)，a Sl-酪蛋白， aS2_酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白； (ii)Bl为剪接接受位点序列； (iii) Cl为含Kozak序列，信号肽编码序列和重组蛋白的编码序列，所述重组蛋白 编码序列编码形成抗体的抗体元件，其中所述的抗体元件选自下组：抗体轻链、抗体重链、 单链形式或完整的单克隆抗体； (iv)Dl为终止密码子以及位于所述密码子下游的抗体蛋白cDNA 3'末端UTR序 列； (V)E为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre - IoxP序列； (Vi)Fl为位于基因定点整合位点下游的3'同源臂序列，所述的3'同源臂序列 选自哺乳动物乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的哺乳动物乳腺特异表达蛋白包括：乳 清酸性蛋白（WAP)，a Sl-酪蛋白，aS2_酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和 α_乳清蛋白；并且所述5'同源臂序列和3'同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且 用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的内含子1区域。 在另一优选例中，所述的5'同源臂含有对应于酪蛋白El外显子及其下游的部分 内含子1序列（如GenBank AF4409096中第3721位-5760位），而3'同源臂含有对应于酪 蛋白的部分内含子1序列和E2外显子序列和任选的E2外显子序列的下游序列（如GenBank AF440906中第5761位-7800位），从而将同源重组的插入位点限定为酪蛋白的内含子1区 域。 本专利技术的第二方面，提供了一种用于乳腺特异性表达的构建物，其特征在于，所述 的构建物从5'至3'依次包括可操作性连接的式II中所示的元件： A2-B2-C2-D2-E-F2 (式 II) 式中， (i)A2为5'同源臂序列，所述5'同源臂序列选自哺乳动物乳腺特异表达蛋白基 因组序列，所述的哺乳动物乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白（WAP)，a Sl-酪蛋白， aS2_酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白； (ii)B2为连接肽的编码序列，所述的连接肽为2A多肽或其衍生多肽，用于连接上 游乳腺特异表达蛋白和下游重组单克隆抗体蛋白C2,该元件经蛋白酶酶切后，其序列保留 于与之连接的上游乳腺特异表达蛋白，将C2从所述上游乳腺特异表达蛋白切下释放而形 成一新的重组单克隆抗体蛋白； (iii)C2为含重组单克隆抗体蛋白编码序列，用于形成抗体的抗体元件，其中所述 的抗体元件选自下组：抗体轻链、抗体重链、单链形式或完整的单克隆抗体； (iv)D2为终止密码子或无； (V)E为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre - IoxP序列； (vi)F2为位于基因定点整合位点下游的3'同源臂序列，所述的3'同源臂序列 选自哺乳动物乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的哺乳动物乳腺特异表达蛋白包括：乳 清酸性蛋白（WAP)，a Sl-酪蛋白，aS2_酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和 α_乳清蛋白；并且所述5'同源臂序列和3'同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且 用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的终止密码子之前。 在另一优选例中，所述的5'同源臂含有对应于酪蛋白E8外显子序列（如GenBank AF409096中第10461位一 12466位本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于乳腺特异表达的供体构建物，其特征在于，所述构建物从5’至3'，依次包括可操作性连接的式I中所示的元件：A1‑B1‑C1‑D1‑E‑F1 (式I)式中，(i)A1为5'同源臂序列，所述5'同源臂序列选自哺乳动物乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的哺乳动物乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1‑酪蛋白，αS2‑酪蛋白，β‑酪蛋白，κ‑酪蛋白，β‑乳球蛋白和α‑乳清蛋白；(ii)B1为剪接接受位点序列；(iii)C1为含Kozak序列，信号肽编码序列和重组蛋白的编码序列，所述重组蛋白编码序列编码形成抗体的抗体元件，其中所述的抗体元件选自下组：抗体轻链、抗体重链、单链形式或完整的单克隆抗体；(iv)D1为终止密码子以及位于所述密码子下游的抗体蛋白cDNA 3’末端UTR序列；(v)E为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre－loxP序列；(vi)F1为位于基因定点整合位点下游的3'同源臂序列,所述的3'同源臂序列选自哺乳动物乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的哺乳动物乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1‑酪蛋白，αS2‑酪蛋白，β‑酪蛋白，κ‑酪蛋白，β‑乳球蛋白和α‑乳清蛋白；并且所述5'同源臂序列和3'同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的内含子1区域。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄跃进，
申请(专利权)人：南京杰蒙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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