利用转基因动物乳腺生物平台大规模生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法技术

本发明专利技术提供了利用转基因动物乳腺生物平台大规模生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法。本发明专利技术首次利用转基因哺乳动物乳腺生物平台大规模高效生产重组人丁酰胆碱酯酶全酶和单体，即不含丁酰胆碱酯酶全酶最后40个氨基酸残基的截断型酶，及丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。所生产的重组蛋白可用于预防和治疗神经毒气中毒，有机磷农药中毒，可卡因中毒和琥珀胆碱引起的呼吸暂停，及用于检测和祛除蔬菜瓜果和其他农作物、各种物件层面及土壤的有机磷农药残留。

【技术实现步骤摘要】
利用转基因动物乳腺生物平台大规模生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法
本专利技术属于生物制药
，具体地涉及利用转基因动物乳腺生物平台大规模生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法。
技术介绍
在过去的四十年中，基因工程技术的发展突飞猛进。大量基因药品陆续问世，年产值达数十亿美元。基因工程药物的生产方法可以分为二大类。第一类方法是将特定的药物基因导入到工程菌或工程细胞中，经细菌或细胞发酵培养，分离纯化得到。这一方法的特点是技术简单，但生产成本高，药物生物学活性不高。第二类方法是转基因动物制药。所谓转基因动物制药是将药物蛋白基因导入到动物体内(如牛或奶山羊)，然后使药物从乳腺或其它器官中生产出来，通过提纯等工序制成基因工程药品。此法的特点是产量高，成本低，药物生物学活性稳定，但是技术较复杂，前期投资较高。近年来，由于基因工程技术的不断完善和动物克隆技术的专利技术，转基因动物制药已成为研发非常活跃的领域。与基因工程细胞反应器相比，转基因动物制药具有高效益、低成本、高产量、高质量、能耗低、无污染等诸多优点。西方发达国家已有二十多年转基因动物制药开发历史，技术已趋成熟。最近，美国GTC公司在羊奶中生产的(一种人体抗凝血蛋白)已获欧洲EMEA和FDA批准，进入欧洲和美国市场。这是第一个通过转基因在羊奶中生产的上市药品，对转基因工业界而言具有里程碑意义。中国虽然在此领域的科学研究已取得进展，但工业化则刚刚起步。胆碱酯酶是一类参与神经递质传递的酯酶总称，其主要功能是在神经胆碱能突触水解乙酰胆碱。此类突触存在于人类、其他脊椎动物及昆虫的神经系统。当这些突触不断发射信号时，肌肉、腺体和神经元会受到刺激或抑制。神经递质乙酰胆碱的作用是传递这些刺激信号，而胆碱酯酶通过水解乙酰胆碱阻止其信号传递。胆碱酯酶抑制物质如有机磷化合物或氨基甲酸酯类杀虫剂及药物能阻止乙酰胆碱水解，造成乙酰胆碱堆积，从而引起神经系统过度活跃。人类和其他动物若接触胆碱酯酶抑制物质，取决于其类型和数量，可造成从轻度如抽搐、颤抖等到严重如呼吸麻痹、惊厥等症状。在极端情况下，引起死亡。胆碱酯酶可由不同数量的催化和非催化亚基组成。这两种酶都由约600个氨基酸的亚单位组成并糖基化。根据其底物偏好和对选择性抑制剂的敏感性，胆碱酯酶分为两大类。那些优先水解乙酰胆碱酯类如乙酰胆碱的酶，其酶活性对化学抑制剂BW284C51敏感，被称为乙酰胆碱酯酶(AChE)，或乙酰胆碱乙酰水解酶(EC3.1.1.7)。乙酰胆碱酯酶又称真实型，特异型，纯正型，红细胞型，或I型胆碱酯酶，是一种膜结合糖蛋白，并以不同分子形式存在于红细胞、神经末梢、肺、脾和大脑灰质。乙酰胆碱酯酶在体内主要用于水解乙酰胆碱。那些优先水解其他类酯如丁酰胆碱的酶，其酶活性对化学抑制剂四异丙酯焦磷酰胺(ISO-OMPA)敏感，被称为丁酰胆碱酯酶(BCHE，EC3.1.1.8)。丁酰胆碱酯酶也被称为假性丁酰胆碱酯酶或非特异丁酰胆碱酯酶。丁酰胆碱酯酶根据其电荷，疏水性，与细胞膜或细胞外结构互动，及亚基组成而进一步分类。该酶又称血浆型，血清型，苯甲酰型，虚假型或II型胆碱酯酶，有超过11个同工酶变异体。丁酰胆碱酯酶优先使用丁酰胆碱和苯甲酰胆碱作为其体外反应底物。该酶存在于哺乳动物血浆、肝、胰、肠粘膜、中枢神经系统白质、平滑肌和心脏。丁酰胆碱酯酶的具体功能尚不明晰，它没有已知的特定自然底物，虽然它也水解乙酰胆碱。尽管胆碱酯酶抑制物质对人体产生破坏性影响，但它们也有治疗用途，能治疗老年痴呆症和帕金森氏病，青光眼，多发性硬化症，重症肌无力等。有机磷化合物在过去50年中应用于战争及作为农药使用使急性和迟发性中毒病例数目持续上升。据估计，每年50-100万农药相关的中毒病例中，死亡人数达19,000人。据统计，2007年中国农药总产量达173万吨，居世界第一位(农药研究与应用2008年第2期)。但是，中国研发的高效、低毒、低残留、环保型农药所占比例较低，杀虫剂在各类农药中所占比重较高，且50%以上是广谱、高毒有机磷杀虫剂。农药大量应用具有较大风险，如由于施用技术不当，环境健康意识不强，过多使用或管理不善而引起的人体急性有机磷农药中毒和农产品农药残留问题，不仅威胁人类健康，还影响到农产品在国际市场的竞争力。目前治疗有机磷中毒主要为接触后静脉注射或肌肉注射各种药物组合，包括氨基甲酸酯类(如吡啶斯的明)，抗胆碱类药(如阿托品)，胆碱酯酶活化剂如氯解磷定(2-PAM，Protopam)。虽然这类药物治疗能有效防止有机磷农药中毒死亡，但对防止抽搐、行为障碍或永久性脑损伤无效。此外，毒物接触后的药物治疗往往无效，因为即使小剂量有机磷化学战剂可能导致瞬间死亡。这些药物缺点导致胆碱酯酶被用于有机磷农药中毒的预防和治疗研究。人体接触后症状可通过丁酰胆碱酯酶预处理而缓解，因为该酶能在有机磷化合物袭击其生理靶标前中和它们。使用胆碱酯酶作为预防药物已成功在动物包括非人类灵长类动物身上得到证明。例如，应用胎牛血清源性乙酰胆碱酯酶或马血清衍生丁酰胆碱酯酶预处理猕猴，能保护他们抵抗2-5倍LD50高毒性有机磷神经毒剂梭曼的袭击(PharmacolExpTher259:633-638,1991；ToxicolApplPharmacol117:189-193,1992)。除预防毒剂致死外，这些预处理还能预防梭曼袭击后的行为丧失症状。服用足够外源性人类丁酰胆碱酯酶可以保护小鼠，大鼠和猴子免于多个致死剂量的有机磷化合物毒性袭击(BiochemicalPharmacology42:2465-2474,1993；ToxicolApplPharmacol145:43-53,1997；ToxicolSci43:121-128,1998)。纯化的人丁酰胆碱酯酶已被用来治疗人类的有机磷农药中毒，无重大不良免疫或心理反应(MinervaAnestesiol54:337,1998)。体外和体内有机磷滴定都显示，有机磷抑制酶类和累积剂量的神经毒剂之间存在1:1化学计量比。有机磷毒剂抑制胆碱酯酶是由于毒剂与胆碱酯酶活性中心丝氨酸形成了稳定的具化学计量比(1:1)的共价体。紧接着是平行的竞争反应，称为“老化”，其中受到抑制的胆碱酯酶被转化成一个不能被常用的活化剂再生的形式。这些活化剂，如活性中心定向亲核体(如季铵肟)，通常分离活性中心丝氨酸的羟基磷成分。衰老过程涉及共价结合有机磷基团脱烷基化，并使治疗某些有机磷中毒如梭曼、沙林和DFP变得非常困难。尽管丁酰胆碱酯酶有因阻止有机磷化合物中毒而作为广泛应用药物的潜能，但由于供应受限目前无法广泛使用。由于提供保护所需的1:1化学计量比，需大量丁酰胆碱酯酶进行有效治疗。目前只能从人血浆中提取。远远不能满足各种需求。除了具有水解有机磷毒素的功效之外，有证据表明，丁酰胆碱酯酶还是可卡因主要解毒酶(MolPharmacol55:83-91,1999)。鉴于丁酰胆碱酯酶的重要药用潜力，研究主要集中利用基因工程方法研发和生产。不同于血浆生产酶类，重组丁酰胆碱酯酶传播传染性病原体包括病毒，如丙型肝炎和艾滋病毒的风险要低很多。据报道，重组丁酰胆碱酯酶已在下列系统中表达：大肠杆菌，显微注射爪蟾卵母细胞(美国专利号5215909)，体外昆虫细胞系及昆虫幼虫体内(Biotech本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达盒，其特征在于，所述表达盒从5'至3'，依次包括可操作性连接的以下元件：(i)绝缘体片段；(ii)酪蛋白启动子或乳清酸性蛋白质(WAP)启动子序列；(iii)至少一个信号肽编码序列(如酪蛋白信号序列)，所述信号肽编码序列提供表达丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体‑白蛋白融合蛋白分泌的信号肽；(iv)重组蛋白编码序列，所述编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体‑白蛋白融合蛋白；和(v)终止密码子；并且，当所述表达盒整合入哺乳动物细胞后，经核移植使转基因哺乳动物乳腺表达并分泌丁酰胆碱酯酶全酶、或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体‑白蛋白融合蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒从5'至3'，依次包括可操作性连接的以下元件：(i)绝缘体片段；(ii)酪蛋白启动子或乳清酸性蛋白质启动子序列；(iii)至少一个信号肽编码序列，所述信号肽编码序列提供表达丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白分泌的信号肽；(iv)重组蛋白编码序列，所述编码序列编码丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，其中所述丁酰胆碱酯酶单体为不形成四聚体的截断型单体，并且所述的丁酰胆碱酯酶或其融合蛋白选自下组：(a)氨基酸序列如SEQIDNo.:2所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体；(b)氨基酸序列如SEQIDNo.:3所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白；和(v)终止密码子；并且，当所述表达盒整合入哺乳动物细胞后，经核移植使转基因哺乳动物乳腺表达并分泌丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。2.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述的信号肽编码序列为酪蛋白信号序列。3.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述的重组蛋白编码序列选自下组：(i)核苷酸序列如SEQIDNo.:5所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体编码DNA序列；(ii)核苷酸序列如SEQIDNo.:6所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白编码DNA序列。4.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1所述表达盒。5.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄跃进，
申请(专利权)人：南京杰蒙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32