本发明专利技术提供了多重数字PCR技术在染色体非整倍体(Aneuploidy)筛查中的应用。具体地，本发明专利技术公开了一种利用多重数字PCR(Multiplex digital PCR，MDPCR)技术对妊娠妇女进行包括唐氏综合症，爱德华氏综合症，帕陶氏综合症和其他染色体异常疾病无创产前筛查(Non-invas ive prenatal screening，NIPS)的方法。该方法具有早期、安全无创、准确、快速、适合大规模检测和临床应用等优点，能避免妇女妊娠中后期胎儿宫内感染、流产、死亡，达到优生优育目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医疗
，具体地涉及利用早期、安全无创、准确、快速、适合 大规模检测和临床应用的多重数字PCR (Multiplex digital PCR，MDPCR)技术对正常妊娠 妇女进行无创产前筛查（Non-invasive prenatal screening，NIPS)包括唐氏综合征，爱德 华氏综合征，帕陶氏综合征和其他多倍染色体疾病筛查的方法。
技术介绍
中国是人口大国，巨大的人口压力会制约社会发展，所以做好优生优育既能提高 人口素质，也能制约人口发展，对未来整个民族的生存与发展有重要作用。预防性优生优育 主要研宄如何降低人群中不利表现型的基因频率，减少以至消除有严重遗传病和先天性遗 传病的个体出生，主要包括遗传咨询、产前筛查、宫内治疗等。 据中国出生缺陷干预救助基金会的数据，中国每年新增出生缺陷约90-120万例， 约占每年出生人口总数的4-6%。现有8000多万残疾人中，约3000万人是出生缺陷所致。 出生缺陷目前已成为儿童致病、致残，甚至死亡的重要原因，其中染色体异常疾病为主要疾 病。孕前和孕早期保健以及产前筛查，是避免与降低新生儿缺陷和实行优生优育的最重要 关卡。以往，那些具有染色体异常疾病患病高风险的夫妇，对于孕育健康的后代，往往处于 无从选择的被动地位。直到1966年，研宄发现了孕妇高龄与唐氏综合症的相关性，此后，产 前筛查得到迅速发展。产前筛查是指在出生前对胚胎或胎儿的发育状态、是否患有疾病等 方面进行检测诊断。从而掌握时机，对可治疗疾病，选择及时进行宫内治疗；对于不可治疗 性疾病，如染色体异常疾病等，能够做到知情选择和预防。 染色体异常疾病，是指染色体的数目异常和/或形态结构变化，可发生于每一条 染色体上，但多发于如21三体（唐氏综合征），18三体（爱德华氏综合征），13三体（帕陶 氏综合征）和性染色体异常等，在自发性流产、死胎、早夭中占50%以上，新生儿中发病率 约1%，是先天性心脏病、智能发育不全、性发育异常及男女不孕不育等的重要原因。随着染 色体分带技术，PCR技术，DNA检测技术等的快速发展，对染色体畸变与疾病关系的认识日 益加深，染色体异常疾病检测日趋增多。约15%的妊娠发生流产，而其中一半为染色体异 常所致，即约为5%-8%的胚胎有染色体异常。不过在出生前，90%以上已有自然流产或死 产。流产愈早，有染色体异常的频率愈高。染色体异常疾病，迄今尚无有效的治疗方法，只 能通过产前筛查/诊断等手段进行一定程度的预防。但目前传统的产前诊断多采用羊膜穿 刺等侵入性取样方法，胎儿宫内感染或流产等的风险增加。 上述传统侵入性产前诊断的缺点，导致染色体异常疾病无创产前筛查/诊断方法 的出现。目前通用的方法包括以细胞为主体的和脱细胞方法，尤以后者居多。胎儿游离DNA 在妊娠母体血液中的存在，和新一代DNA检测技术的不断改进，使得无创产前筛查/诊断更 加容易开展。仅需采取孕妇静脉血，利用新一代DNA检测技术对母体外周血浆中的游离DNA 片段（包含胎儿游离DNA)进行检测分析从而检测胎儿是否患染色体异常疾病。但妊娠早 期，主要来自胎盘细胞的胎儿游离DNA只占母体血液DNA的10-20 %。而目前常用的新一代 DNA测序技术，检测耗时较长，需用复杂的仪器和生物信息学软件分析大量的DNA序列，1-2 周获检测结果，且耗费许多试剂和耗材，价格昂贵。数字PCR(digi tal PCR)是近年来快 速发展起来的一种新型定量分析技术，通过将单个样本分成超过数万，甚至数百万、数千万 份分布于不同的反应单元，每个单元包含无或一个或多个拷贝的DNA模板，分别对这些DNA 模板进行PCR扩增，然后对各个反应单元的荧光信号进行分析。dPCR可不需要对照标准样 品和曲线实现绝对定量分析。尤其需要指出的是，将多重PCR技术与dPCR技术有机结合 (MDPCR)，便可大幅提高dPCR多重性达20-50以上。 因此本领域迫切需要开发一种早期、安全无创、准确、快速、适合大规模检测和临 床应用的新方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种对染色体疾病进行早期筛查的方法。 本专利技术第一方面，提供了一种体外非诊断性的检测目标染色体非整倍体 (Aneuploidy)的方法，包括步骤： (a)提供含有胎儿游离DNA的妊娠对象外周血样本； (b)从所述外周血样本分离去除细胞，并从去除细胞的所述样本中富集DNA，得到 DNA样本； (c)将所述DNA样本分为对照组和实验组，其中， 在实验组中，以所述DNA样本为模板，用扩增目标染色体基因的nl对第一引物对 进行多重数字PCR，并记录阳性点个数C1与引物对数量nl之比，记为al，其中al = Cl/nl， 且nl彡2,优选地，nl彡5 ; 在对照组中，以所述DNA样本为模板，用扩增参照染色体基因的n2对第二引物对 进行多重数字PCR，并记录阳性点个数C2与引物对数量n2之比，记为a2,其中a2 = C2/n2， 且nl彡5,优选地，nl彡5 ; ⑷将所述al值与a2值进行比较，从而确定目标染色体的倍数。 在另一优选例中，所述的参照染色体为二倍体。 在另一优选例中，所述的胎儿和所述的妊娠对象包括小鼠、大鼠、或人，优选地，为 人。 在另一优选例中，所述的第一引物对和/或第二引物对所扩增的PCR产物中，有至 少一个引物或探针经荧光标记。 在另一优选例中，所述步骤（b)还包括步骤（bl):将所述的DNA样本进行片段化 处理，从而获得片段化的DNA样本。 在另一优选例中，所述的片段化处理包括物理和生化处理，如碎化、超声处理和酶 切。 在另一优选例中，所述的片段化的DNA样本大小彡3000bp。 在另一优选例中，计算al/a2值记为R， 当R等于或约等于0. 5(即接近于0. 5)时，则表明所述的样本中所述目标染色体 为单倍体；当R等于或约等于1(即接近于1)时，则表明所述的样本中所述目标染色体与参 照染色体的倍数相同； 当R等于或约等于1.025时，则表明所述的样本中只有5%胎儿游离DNA样本的目 标染色体为三倍体，而其余95 %妊娠母体DNA样本的目标染色体仍为二倍体； 当R等于或约等于1.05时，则表明所述的样本中只有10%胎儿游离DNA样本的目 标染色体为三倍体，而其余90 %妊娠母体DNA样本的目标染色体仍为二倍体； 当R等于或约等于1. 5 (即接近于1. 5)时，则表明所述的样本中所述目标染色体 为3倍体； 当R等于或约等于2 (即接近于2)时，则表明所述的样本中所述目标染色体为4 倍体。 在另一优选例中，当R与1离散时，则表明所述的样本中含有多倍染色体。在另一优选例中，所述各对第一引物的扩增产物的长度为50-150bp，较佳地 60_120bp。 在另一优选例中，所述的nl对第一引物中的每对引物是特异性扩增21号染色体 的引物。 在另一优选例中，所述的目标染色体为可发生染色体数量变异疾病的染色体，优 选地包括21号染色体、13号染色体、18号染色体、性染色体。 在另一优选例中，所述的参照染色体为正常染色体。 在另一优选例中，所述的参照染色体包括21号染色体、13号染色体、18号染色体。 在另一优选例中，所述目标染色体基因包括21号染色体的 Usp2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种体外非诊断性的检测目标染色体非整倍体(Aneuploidy)的方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供含有胎儿游离DNA的妊娠对象外周血样本；(b)从所述外周血样本分离去除细胞，并从去除细胞的所述样本中富集DNA，得到DNA样本；(c)将所述DNA样本分为对照组和实验组，其中，在实验组中，以所述DNA样本为模板，用扩增目标染色体基因的n1对第一引物对进行多重数字PCR，并记录阳性点个数C1与引物对数量n1之比，记为a1，其中a1＝C1/n1,且n1≥2，优选地，n1≥5；在对照组中，以所述DNA样本为模板，用扩增参照染色体基因的n2对第二引物对进行多重数字PCR，并记录阳性点个数C2与引物对数量n2之比，记为a2，其中a2＝C2/n2,且n1≥5，优选地，n1≥5；(d)将所述a1值与a2值进行比较，从而确定目标染色体的倍数。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄跃进，季红峰，魏艳，
申请(专利权)人：南京杰蒙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。