一种胎儿游离DNA文库定量的标准品及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于半导体测序法检测胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检的文库DNA浓度的qPCR定量标准品及其制备方法，属于胎儿非整倍体的无创产前检测范畴，对检测样本的检测浓度进行质量控制。本发明专利技术qPCR定量标准品制备方法分为五步：(1)接头序列与引物合成：(2)模拟胎儿游离DNA的文库制备；(3)文库扩增与纯化；(4)制作文库标准曲线；(5)样本检测本。本发明专利技术方法可以快速确定样品文库DNA浓度，为胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体无创产前检测的准确性和有效性提供了保证。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制品
，属于胎儿染色体非整倍体的无创产前检测范畴， 涉及半导体测序法检测胎儿染色非整倍体21三体、18三体、13三体的文库DNA浓度的qPCR 定量标准品及其制备方法。
技术介绍
染色体非整倍体是指相对于人的正常的46条染色体而言，细胞中的某一条或几 条染色体数目增加或减少，与婴幼儿期显著的发病率和死亡率有着密切关系。该类疾病的 发病率随着孕妇年龄的增高而增高。据文献报道我国每年出生染色体异常的新生儿约10 万人，在活婴儿中染色体异常者占0. 3%，而其中21三体、18三体、13三体综合征是临床最 常见和最易出现的染色体异常疾病。目前21三体、18三体、13三体综合征的治疗缺乏有效 方法，因此普及染色体疾病的产前筛查和产前诊断，对降低出生缺陷的发生有着非常重要 的意义，这有利于提尚人口质量，实现优生优育。 利用高通量测序技术对胎儿染色体非整倍体进行检测的方法相比传统方法具有 明显优势。该方法只需抽取母体外周血进行检测，可以避免传统的侵入性方法可能给孕妇 和胎儿带来的危害；另外直接检测母亲和胎儿的DNA序列，相比于检测血清蛋白标志物和 超声波检测，准确性和灵敏度以及可靠性都大大提高。因此，通过深度测序，能够对孕妇血 浆微量胎儿游离DNA进行准确检测，可以克服传统检测方法因胎儿游离DNA含量过低而导 致检测结果假阴性过高的缺点。胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂 盒（半导体测序法）基于高通量测序原理，对这些胎儿游离DNA进行检测，利用生物信息学 分析系统对检测结果进行分析，获得胎儿染色体数目的详细信息，实现对21三体综合征、 18三体综合征和13三体综合征进行快速的产前辅助诊断。通过半导体测序实验得到的DNA 数据量（UniqueReads数）需达到3· 5MReads(原始Reads需5M左右）才能对胎儿染色 体非整倍体的症状进行明确判断。 目前半导体测序系统上对样品进行检测，每次实验可产出80M左右的Reads，理论 每次实验可检测16个样品。但由于测序芯片中含有165M个微孔，需要的文库DNA分子量 仅为10s个DNA拷贝数，即10 15mol，如此低的浓度必定会造成16个样本很难等量均匀地混 合，这将导致某些样本测序得到的数据量达不到要求而需要重新检测，这既浪费了成本，也 拖延了检测时间。目前胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒（半导 体测序法）每次建议检测12个样品，因此在保证每个样本DNA都能达到足够Reads数的前 提下，增加单次实验的样品数量成为了必要。 现有胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒（半导体测序 法）文库浓度是用Qubit荧光法检测的，只有当DNA与荧光的MolecularProbes?染料结合 后，才能发出荧光信号，因此该方法只检测靶分子（而不是污染物）的浓度，相对于传统的 Nanodrop?分光光度更准确，更精密。但Qubit检测方法在高通量基因测序过程同样有一 定的缺陷，即检测范围为〇.lng/μL-10ng/μL，对于加入的10s个DNA分子难以精确定量。 因此最低可以检测到100个DNA分子拷贝的qPCR技术应用在高通量测序上无疑是非常必 要的。利用DNA标准品建立标准曲线，得到文库DNA的拷贝数，再进行等量混合后上机测序。 目前，市场上该检测方法涉及的文库DNA浓度的qPCR定量标准品几乎没有，这严 重影响染色体疾病的产前筛查和诊断过程的效率，增加了成本。为增加检验试剂盒在检测 过程中的有效性，本专利技术以高通量测序技术用于孕妇血浆游离胎儿DNA的染色体非整倍体 (T2UT18和T13)国家标准品为溯源，然后将人类基因组DNA打断成长度为160~200bp的 DNA片段，利用该试剂盒进行文库制备，经Qubit2. 0检测后稀释至一定浓度作为胎儿染色 体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒（半导体测序法）文库DNA浓度检测的 qPCR定量标准品。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试 剂盒（半导体测序法）文库DNA浓度的qPCR定量标准品及其制备方法。 为了实现本专利技术目的，专利技术了一种胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体 检测试剂盒（半导体测序法）文库DNA浓度的qPCR定量标准品。 本专利技术的qPCR定量标准品为含有一段长度为260bp左右DNA片段的无核酸酶溶 液。 本专利技术的qPCR定量标准品的DNA片段两端含有测序的接头序列，与文库DNA特征 相同。 本专利技术的qPCR定量标准品涉及文库DNA定量标准曲线的建立。 本专利技术qPCR定量标准品制备方法： (1)接头序列与引物合成：合成接头序列双链AdapterS1和AdapterS2,并在接 头序列上设计qPCR扩增的引物对NIPT-LibraryF与NIPT-LibraryR，如下： AdapterS1 ： 5r -CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3r (+) 3， -C*C*C*GGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTC-5，（-) AdapterS2 : 5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3r (+) 3 ' -OOOGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5，（-) NIPT-LibraryF:5，-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3' NIPT-LibraryR:5'-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3' (2)模拟胎儿游离DNA的文库制备：提取人类基因组DNA，将其物理超声（条件：频 率0. 5min超声/0. 5min冷却停止，15min/循环，3个循环）打断为160bp~200bp的DNA 片段；利用T4DNA连接酶将AdapterS1和AdapterS2序列与160bp~200bp的DNA片段 进行连接后，E-Gel胶回收260bp片段； (3)文库扩增与纯化：利用NIPT-LibraryF、NIPT-LibraryR引物与高保真 DNA聚合酶扩增步骤（2)中回收的DNA片段，反应程序为：98°C2min，98°C15s，62°C15s， 70°Clmin，共10个循环，70°C延长5min;继而利用磁珠纯化得到的DNA片段并溶解于无核 酸酶水中； (4)制作文库标准曲线：利用Qubit 2.0定量构建好的文库标准品在测序仪上检 测，得到Reads数大于80M后再进行10倍梯度的稀释，进行qPCR检测，得到Ct值并建立标 准曲线； (5)样本检测：待检样本的文库DNA通过文库标准曲线进行浓度确定后用测序仪 检测，增加样本之间数据量的均匀性。 本专利技术的qPCR标准品为白色透明的DNA溶液，具有稳定、易保存和不危害操作者 健康的优点，同时qPCR标准品制备瓶间差变异系数较小，这说明本专利技术的使用，可以用于 胎儿染色体疾病的产前无创筛查和诊断。 本专利技术能够有效的避免同一批次文库DNA浓度的检测结果出现偏差，为增加21三 体、18三体和13三体无创产前检测样本之间的均一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胎儿游离DNA文库定量的标准品及其制备方法，所述标准品为无核酸酶的DNA水溶液，其制备方法如下：(1)接头序列与引物合成：合成接头序列双链Adapter S1和Adapter S2，并在接头序列上设计qPCR扩增的引物对NIPT‑Library F与NIPT‑Library R，如下：Adapter S1：5′‑CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG‑3′(+)3′‑CCCGGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTC‑5′(‑)Adapter S2：5′‑CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT‑3′(+)3′‑CCCGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA‑5′(‑)NIPT‑Library F：5’‑CCATCTCATCCCTGCGTGTC‑3’NIPT‑Library R：5’‑CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT‑3’(2)模拟胎儿游离DNA的文库制备：提取人类基因组DNA，将其物理超声打断为160bp～200bp的DNA片段；利用T4DNA连接酶将Adapter S1和Adapter S2序列与160bp～200bp的DNA片段进行连接后，E‑Gel胶回收260bp片段；(3)文库扩增与纯化：利用NIPT‑LibraryF、NIPT‑LibraryR引物与高保真DNA聚合酶扩增步骤(2)中回收的DNA片段，继而利用磁珠纯化扩增DNA并溶解于无核酸酶水中；(4)制作文库标准曲线：利用Qubit 2.0定量构建好的文库标准品在测序仪上检测，得到Reads数大于80M后再进行10倍梯度的稀释，经qPCR检测后得到Ct值并建立文库标准曲线；(5)样本检测：待检样本的文库DNA通过文库标准曲线进行浓度确定后用测序仪检测，增加样本之间数据量的均匀性。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，高旭年，杨学习，李尔华，杨旭，雷孝锋，
申请(专利权)人：广州市达瑞生物技术股份有限公司，广州邦德盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44