本发明专利技术公开一种在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶(Apobec3B/C、Apobec3F/G、AID)及其相关分子(UNG)基因表达的试剂盒及其引物对组，该引物对组如序列表SEQ ID No：1至SEQ ID No：8所示。包含该引物对组的试剂盒通过对Apobec3B/C、Apobec3F/G、AID和UNG基因启动子甲基化修饰的检测，评估癌症发病的风险以及治疗效果，该检测方法具有高敏感性、特异性、直接性、实时性和稳定性的特点。
【技术实现步骤摘要】
在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及其相关分子基因表达的试剂盒及其引物对组
本专利技术涉及利用外周血游离DNA进行肿瘤筛查、疗效评估以及预后预测的试剂盒。属生物
技术介绍
随着肿瘤的发病率的逐年提高，肿瘤正在成为常态化的疾病，而肿瘤治疗的有效性取决于早期发现，目前肿瘤的筛查手段主要依赖于影像学，但影像学由于受制于物理学的分辨率限制，使肿瘤难以真正做到早时期发现，于是就出现了要么检测结果正常要么已经是中晚期的尴尬局面，所以临床迫切需要建立新的有助于肿瘤早期发现的手段，这样肿瘤的分子检测就应运而生。传统的肿瘤标志物主要是肿瘤代谢相关的蛋白分子，多年来的临床资料表明，其敏感性与特异性较低，其中在部分肿瘤患者中这些指标没有变化，限制了其在肿瘤筛查中的应用，目前仅用于对这些指标有明显异常患者的疗效评估上，所以迫切需要推出新型的肿瘤标志物。研究表明肿瘤的发生发展过程中，均不同程度涉及基因突变、缺失以及染色体移位的等变化，而且这些变化是一个持续性的过程，即不同类型肿瘤以及同一肿瘤不同进展阶段，其基因的异常各不相同，是造成突变具有肿瘤广泛的异质性的重要原因,尽管近年来针对这些基因异常的检测已成为肿瘤风险预测、靶向药物用药指导以及疗效评估的重要手段,但由于基因变异的异质性特点,造成了检测的困难与高成本，需要探索新的检测方法。进一步对肿瘤细胞基因组研究发现，这些突变并非随机的，其中绝大部分突变发生在胞嘧啶碱基上，这种序列特异性正是胞嘧啶脱氨酶作用的位点，可见胞嘧啶脱氨酶就是造成基因突变的始作俑者。目前发现导致胞嘧啶脱氨的酶包括：Apobec3s家族(ApolipoproteinBmRNA-editingcatalyticpolypeptide)，AID(Activation-inducedCytidineDeaminase)，其作用底物是单链DNA中的胞嘧啶。通过脱氨基作用形成尿嘧啶(U)，导致C>U的突变，如突变不能及时切除则在随后的复制中出现由C:G向A:T的突变；如C>U的突变被UNG(UracilNucleotideGlicosylase)识别，则随后启动切除修复，在此修复过程中，受制于多种因素的影响，同时也可能在切除U碱基留下的空缺位置上随机添加任何碱基，导致出现多种可能的突变，进一步还可导致基因断裂、缺失、融合以及染色体转位等异常。这就是为什么肿瘤基因组中经常出现基因突变、异常融合以及染色体转位的原因。胞嘧啶脱氨酶是细胞应激反应基因，Apobec3家族在人类共发现有七个成员(Apobec3A,Apobec3B,Apobec3C,Apobec3D,Apobec3F,Apobec3G,Apobec3H),其主要功能是限制病毒的感染以及基因组内自主性转座子的活性，研究发现这些成员(特别是Apobec3B)的过量表达将导致包括TP53和APC等在内的肿瘤相关基因出现大量的突变，最终导致的癌症的发生。这样也就从机制上阐明了病毒长期感染最终导致肿瘤形成的原因。AID在B细胞抗体多样性调控中具有重要的作用，正是由于其造成的突变，才使B细胞产生多样化的抗体，如在非B细胞中激活则会提高其它基因出现突变的风险，报道显示：转基因动物中AID过表达可导致Myc基因突变，同时还介导IGH-MYC易位，形成淋巴瘤；幽螺门杆菌也被发现可上调AID，增加TP53的突变率，可能也是幽螺门杆菌诱发胃癌的重要机制。另外，UNG作为细胞对胞嘧啶突变修复的重要酶分子，在肿瘤细胞中也常表现为高表达，但活性不高，不能有效修复胞嘧啶脱氨引起的突变。可见细胞在进化过程中，通过采取对入侵者基因突变的方式，限制其活性，但同时作为双刃剑，也增加了自身DNA出现突变的风险，其持续性的高表达是造成细胞转化以及肿瘤进展的重要原因，同时也是造成肿瘤细胞异质性的根源。在临床应用过程中，特别是对肿瘤发病风险评估的检测中，血液标本以其无创、快速、方便的特点无疑是最好的素材。研究表明，外周血中含有大量的游离DNA(血浆或血清中的DNA)，这些DNA可能来自于正常细胞死亡的释放物，也可能来自于肿瘤或癌前病变细胞的死亡释放物，通过对肿瘤来源的游离DNA检测将为肿瘤风险性以及疗效评估带来的可行性。这样在外周血中，通过对胞嘧啶脱氨酶及其相关基因表达的检测，将可用于对肿瘤发病风险以及治疗有效性的评估。综上所述，通过该检测将有助于肿瘤早期风险的预测，同时也可评估肿瘤的疗效以及复发的危险性，所以该检测在肿瘤预防以及治疗均具有重大的指导意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及其相关分子基因表达的引物对组。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及其相关分子基因表达的试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：针对Apobec3s、AID以及UNG基因表达状况的检测方法，我们采取对其进行启动子甲基化分析，在此过程中我们采取甲基化敏感的限制性内切酶处理方法，比较酶切前后的Ct值的差值，评估酶切位点的甲基化程度。其中针对Apobec3家族，我们选择了在肿瘤细胞中广泛高表达的成员Apobec3B、Apobec3C、Apobec3F和Apobec3G，在对其启动子序列分析发现，Apobec3B与Apobec3C的有部分完全同源，而Apobec3F与Apobec3G与也有部分完全同源，这样，我们分别选取这些同源部分序列，进行甲基化程度分析；另外，我们也对AID和UNG基因启动子甲基化程度进行了分析。通过采用对游离DNA高富集方法，我们成功实现了在外周血中对上述靶基因启动子甲基化程度的检测。在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及其相关分子基因表达的引物对组，该引物对组如序列表SEQIDNo：1至SEQIDNo：8所示。其中，序列SEQIDNo：1和SEQIDNo：2分别为扩增Apobec3B/C基因的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo：3和SEQIDNo：4分别为扩增Apobec3F/G基因的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo：5和SEQIDNo：6分别为扩增AID基因的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo：7和SEQIDNo：8分别为扩增UNG基因的上游引物和下游引物。具体序列如下：Apobec3B/C上游引物：5’-GCCAGAGCCAGAGAAACATGAAG-3’(SEQIDNO：1)Apobec3B/C下游引物：5’-TGCTTACAGCGTCCTTGCAGTTG-3’(SEQIDNO：2)Apobec3F/G上游引物：5’-TTGTGCTCTGCTGGCTCAGC-3’(SEQIDNO：3)Apobec3F/G下游引物：5’-GGACCCAAGGCAATTGCAAAG-3’(SEQIDNO：4)AID上游引物：5’-TTGAAGTGTCTACTGTTACTGCC-3’(SEQIDNO：5)AID下游引物：5’-CTGTCATAGGCAGAGTCACACA-3’(SEQIDNO：6)UNG上游引物：5’-TGCCTGAGGAAAGCGGAGATG-3’(SEQIDNO：7)UNG下游引物：5’-CACGTGGAGGCTATTTGGAAAG-3’(SE本文档来自技高网...
【技术保护点】
在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及其相关分子基因表达的引物对组，其特征在于，所述引物对组序列如序列表SEQ ID No：1至SEQ ID No：8所示。
【技术特征摘要】
1.在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及其相关分子基因表达的引物对组，其特征在于，所述引物对组序列如序列表SEQIDNo：1至SEQIDNo：8所示。2.一种包括权利要求1所述在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及其相关分子基因表达的试剂盒，其特征在于，包括由序列表SEQIDNo：1至SEQIDNo：8所示的引物对组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括限制性内切酶及其酶切反应液，其中所述限制性内切酶及其酶切反应液包括：HpaII内切酶、NheI内...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱运峰，刘芳，田红池，吕程程，
申请(专利权)人：朱运峰，
类型：发明
国别省市：北京;11
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