一种微小卡罗藻的检测方法技术

本发明专利技术提供一种微小卡罗藻的检测方法，设计了三对LAMP引物FIP、BIP、LF、LB、F3和B3，其中FIP为5’端生物素标记引物，LF为5’端异硫氰酸荧光素FITC标记探针，配制含三对引物和样品模板的LAMP反应体系步骤，对LAMP反应体系进行扩增，然后用LFD试纸条检测，并随后进行了灵敏度和特异性评价。本发明专利技术具有比现有传统技术PCR检测微小卡罗藻的方法更高的特异性、灵敏度、实用性及便捷性，可以在实际野外现场应用，有利于检测和控制微小卡罗藻的爆发，提前做好预防。运用本发明专利技术的方法对有害藻类微小卡罗藻的检测，能有效的预防有害藻类微小卡罗藻发生大规模赤潮，这对保护我国海洋及水产养殖具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种微小卡罗藻的检测方法
本专利技术属于有害藻类检测
，具体涉及一种有害藻类微小卡罗藻Karlodiniumveneficum的检测方法。
技术介绍
微小卡罗藻Karlodiniumveneficum(K.micrum)是一种常见的有毒赤潮甲藻，它属于裸甲藻目(Gymnodiniales)、凯伦藻科(Kareniaceae)、卡罗藻属(Karlodinium)。在自然海区该藻能够形成赤潮及产生鱼毒、溶血性毒素和细胞毒活性等有害物质，这些毒素会使鱼及其他海洋生物受到伤害。据报道，该藻在美国南卡罗来纳州地区，引起过赤潮，并导致鱼类大量死亡。在欧洲、非洲等很多地方也有报到过该藻引起赤潮并导致鱼类死亡事件。2003年，在中国香港海域发生过由微小卡罗藻引起的赤潮。2007年6月,在浙江象山湾的一个虾池中微小卡罗藻大量爆发。现阶段，用于检测微小卡罗藻的方法主要通过显微镜观察其形态学特征。但由于微小卡罗藻个体微小，很难进行样品处理及观察，这需要实验人员具备丰富的经验。因此，需要找到一种更快，更方便，更适合微小卡罗藻的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速检测有害藻类微小卡罗藻的检测方法，以实现对微小卡罗藻进行安全、特异、快速、灵敏、简单的现场快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。本专利技术首先提供一种检测微小卡罗藻的环介导等温扩增引物组，包含有以下的引物：F3引物KV-F3:5′-AAGCATGCCTTCTTCAGTGT-3′(SEQIDNO:1)、B3引物KV-B3:5′-CTGGAGCAGGCTACGAGT-3′(SEQIDNO:2)、FIP引物KV-FIP:5′-TGACACACAAACACGCACCCATTGATTTTCATGCCCCTGACG-3′(SEQIDNO:3)、BIP引物KV-BIP:5′-TGGCCTTTGACGCATTCAGTGTACACAACGAAAGAGACACCG-3′(SEQIDNO:4)、LF引物KV-LF:5′-GACAGCACCAAGAGAAGACTTG-3′(SEQIDNO:5)LB引物KV-LB:5′-TAGCGTCTCCAACGAGCAACT-3′(SEQIDNO:6)；作为优选，FIP引物KV-FIP的序列如下:5′-TGACACACAAACACGCACCCATTGATTTTCATGCCCCTGACG-3′(SEQIDNO:7)、BIP引物KV-BIP的序列如下:5′-TGGCCTTTGACGCATTCAGTGTACACAACGAAAGAGACACCG-3′(SEQIDNO:8)。作为实施例的优选，KV-FIP的5′端进行生物素标记，LF引物KV-LF的5′端进行异硫氰酸荧光素FITC标记；本专利技术还提供一种检测有害藻微小卡罗藻的方法，包括如下的步骤1)配制LAMP反应体系：各引物的终浓度为：内引物KV-FIP和KV-BIP各1.6μmol/L，外引物KV-F3和KV-B3各0.2μmol/L，环引物KV-LF和KV-LB各0.8μmol/L；缓冲液组成及浓度为：Tris-HCl(pH8.8)20mmol/L、KCl10mmol/L，MgSO48mmol/L，(NH4)2SO410mmol/L，0.1％的Tween20，Betaine0.8mol/L，dNTPs1.4mmol/L；8UBstDNA聚合酶和2μL样品DNA模板，加双蒸水使反应体系总体积为25μL；2)LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行核酸扩增反应，扩增反应所需温度为61℃-65℃，扩增反应所需时间为30min-60min；3)LFD检测：取8μL核酸扩增产物将产物加入到100μLBuffer中混匀，然后将LFD试纸条垂直浸入混合溶液中显色检测，通过试纸条判断扩增结果。其中步骤2中所述的最适反应温度为63℃，最适反应时间为45min。本专利技术所提供的微小卡罗藻的LAMP-LFD检测方法具有如下优点：一、高灵敏度，对微小卡罗藻的检测最低线可至74pg/μL，其检测灵敏度比传统PCR的检测灵敏度高10倍。二、强特异性，所用的特异性引物根据微小卡罗藻的ITS基因中的六个不同区域设计，其中LF同时做为DNA特异性探针，该检测特异性比常规PCR强很多。三、检测时间较短，50分钟左右可获得检测结果，比常规PCR检测时间节省2-4h。四、仪器设备要求低，不需要PCR仪、电泳仪和凝胶成像系统，只需一个恒温加热器即可完成检测。五、操作简便、结果呈现明显，整个检测过程不涉及复杂昂贵仪器和设备，稍具有分子生物学基础的人员即可完成整个操作；检测结果清晰明显，直接通过肉眼观察即可判别。六、对实验人员和环境更安全，检测过程不需要进行凝胶电泳故不使用EB等有毒试剂。综上所述，本专利技术具有比现有传统技术PCR检测微小卡罗藻的方法更高的特异性、灵敏度、实用性及便捷性，可以在实际野外现场应用，有利于检测和控制微小卡罗藻的爆发，提前做好预防。运用本专利技术的方法对有害藻类微小卡罗藻的检测，能有效的预防有害藻类微小卡罗藻发生大规模赤潮，这对保护我国海洋及水产养殖具有重要意义。附图说明图1：微小卡罗藻ITS基因的LAMP-LFD引物和探针设计示意图，引物和探针由方框圈出、图2：PCR检测微小卡罗藻的灵敏度图、图3：LAMP检测微小卡罗藻的灵敏度图、图4：LAMP-LFD检测微小卡罗藻灵敏度图、图2和图4中，泳道M为DL2000DNAmarker,NC为阴性对照，1泳道为100(模板浓度74ng/μL),2-8泳道依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍稀释的基因组DNA。图5：LAMP琼脂糖电泳检测微小卡罗藻的特异性图、图6：LAMP检测微小卡罗藻的特异性图；图7：LAMP-LFD检测微小卡罗藻的图；图5和图7中，泳道M为DL2000DNAmarker,NC为阴性对照，1-8泳道依次为：微小卡罗藻、塔玛亚历山大藻、东海原甲藻、海洋原甲藻、微小原甲藻、赤藻异湾藻、中肋骨条藻、米氏凯伦藻。具体实施方式LAMP-LFD技术是环介导恒温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification)与横向流动试纸条(Lateralflowdipstick)相结合的一种新颖的检测技术，该技术将核酸横温扩增和可视化试纸条检测有机的结合。环介导等温扩增技术(LAMP)，只需要在恒温(60℃–65℃)条件下保温几十分钟，即可将所需目的基因扩增到109水平。横向流动试纸条(LFD)，融合了免疫层析技术和分子生物学手段，能在纸条上形成有颜色的检测线从而可以特异性地检测出该目标产物。环介导横温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)相互结合的技术，使LAMP扩增产物现场检测可视化，检测结果明显直观，通过肉眼即可辨认，LAMP-LFD结合方法安全、快捷、高效、高灵敏度且无设备及技术限制，具有其他技术所无法替代的优势。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案包括以下三个部分：1、提供3对用于微小卡罗藻的LAMP引物序列，即长度分别为20bp、18bp、32bp、42bp、22bp和21bp的寡核苷酸序列，依次命名为KV-F3、KV-B3、KV-FIP、KV-BIP、KV-LF和KV-LB；2、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种LAMP引物组，其特征在于，所述的引物组包含有：F3，序列为AAGCATGCCTTCTTCAGTGT、B3，序列为CTGGAGCAGGCTACGAGT、FIP，序列为TGACACACAAACACGCACCCATTGATTTTCATGCCCCTGACG、BIP，序列为TGGCCTTTGACGCATTCAGTGTACACAACGAAAGAGACACCG、LF，序列为GACAGCACCAAGAGAAGACTTG、LB，序列为TAGCGTCTCCAACGAGCAACT。

【技术特征摘要】
1.一种LAMP引物组，其特征在于，所述的引物组包含有：F3，序列为AAGCATGCCTTCTTCAGTGT、B3，序列为CTGGAGCAGGCTACGAGT、FIP，序列为TGACACACAAACACGCACCCATTGATTTTCATGCCCCTGACG、BIP，序列为TGGCCTTTGACGCATTCAGTGTACACAACGAAAGAGACACCG、LF，序列为GACAGCACCAAGAGAAGACTTG、LB，序列为TAGCGTCTCCAACGAGCAACT；所述的FIP的5′端用生物素标记；所述的LF的5′端用FITC标记。2.权利要求1所述的引物组在检测微小卡罗藻中的应用。3.一种检测微小卡罗藻的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的引物组。4.一种检测有害藻类微小卡罗藻的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤1)配制LAMP反应体系：各引物的终浓度为：权利要求1所述的引物组中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱鹏，黄海龙，严小军，高威芳，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33