一种小麦微生物定性与定量的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种小麦微生物定性与定量的检测方法，属于生物技术领域。所述方法包括以下步骤：确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存在于所述待测样品中的参考微生物；设计目标微生物类群与目标微生物的特征区域；设计特征区域的多重扩增引物；在待测样品中加入参考微生物与外源核酸后，提取待测样品中的微生物的核酸；利用设计的多重引物扩增微生物核酸，扩增获得特征测序片段；利用特征测序片段定性、定量分析待测样品中微生物。本发明专利技术不需要对微生物进行预培养与增殖，可以一次性地对待测样品中的多种已知微生物进行高通量、高准确度、高分辨率的检测，检测过程简单、快速且流程规范。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种小麦微生物定性与定量的检测方法。
技术介绍
小麦微生物是小麦病害鉴定与预报，小麦食品安全的重要依据，小麦微生物精确地定性与定量检测是十分必要的。现有小麦微生物定性与定量检测技术包括形态学计数、芯片检测、16SrRNA测序、宏基因组测序和实时定量PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应)。形态学计数检测需要对微生物进行预培养，耗时长，不可培养微生物不可检测，一次仅能够检测一种微生物，通量低，在计数时抽样量有限，且结果粗糙，无法对种以下的分类单元进行区分。芯片检测所需的待测样品的DNA量大，需要对微生物进行预培养及富集处理，检测结果不准确，且无法做定量检测。16SrRNA测序无法对种以下的分类单元进行区分。宏基因组测序深度有限，对于低含量的微生物的定量检测准确度很差。实时定量PCR一次只能检测一种微生物，通量低。另外，已有方法共有缺陷是，无法计算微生物定性与定量的可靠性，使得结论实用性差。
技术实现思路
为了解决现有技术中微生物定性与定量检测不准确的问题，本专利技术实施例提供了一种小麦微生物定性与定量的检测方法。所述技术方案如下：本专利技术实施例提供了一种小麦微生物定性与定量的检测方法，所述方法包括：确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存在于所述待测样品中的参考微生物，所述待测样品为小麦；根据所述目标微生物类群、所述目标微生物、所述参考微生物和所述非目标生物的参考基因组序列，获得所述目标微生物类群的特征区域、所述目标微生物的特征区域和所述参考微生物的特征区域；制备扩增所述目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增所述目标微生物的特征区域的第二多重扩增引物和扩增所述参考微生物的特征区域的第三多重扩增引物，将所述第一多重扩增引物、所述第二多重扩增引物和所述第三多重扩增引物混合得到混合多重扩增引物；向所述待测样品中加入所述参考微生物，获得混合样品；提取所述混合样品的核酸；利用所述混合多重扩增引物和所述混合样品的核酸进行扩增反应，获得扩增产物；利用所述扩增产物进行高通量测序，获得高通量测序片段；根据所述高通量测序片段，对所述目标微生物类群和所述目标微生物进行定性和定量分析。具体地，所述目标微生物类群的数目≥1个，且每个所述目标微生物类群包括≥0种所述目标微生物；所述目标微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体和原生动物中的至少一种；所述参考微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体和原生动物中的至少一种。具体地，所述确定待测样品中的非目标生物的方法包括：将所述非目标生物确定为除所述目标微生物类群之外的所有生物，若能获得所述目标微生物类群的特征区域，则所述非目标生物指除所述目标微生物类群之外的所有生物；若不能获得所述目标微生物类群的特征区域，则所述非目标生物指所述混合样品中，除所述目标微生物类群之外的其它生物。具体地，所述目标微生物类群的特征区域为所述目标微生物类群内的微生物的参考基因组上的核酸序列；所述目标微生物类群的特征区域的两侧的序列在所述参考基因组中为单一序列；所述目标微生物类群的特征区域的两侧的序列在所述目标微生物类群内不同微生物间保守；所述目标微生物类群的特征区域的区分度≥3；所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群的特征区域同源；所述目标微生物的特征区域的m2值≥2，其中，m2值为所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群内除所述目标微生物外的其它所述微生物间的差异碱基数的最小值；所述参考微生物的特征区域为所述参考微生物的参考基因组上的核酸序列；所述参考微生物的特征区域的两侧的序列在所述参考微生物的参考基因组中为单一序列；所述参考微生物的特征区域的两侧的序列在除所述参考微生物外的其它生物中不具有同源性。进一步地，所述区分度是指由同一所述混合多重扩增引物扩增的任一所述目标微生物类群的特征区域与任一非特征区域间的差异碱基数的最小值，其中，所述非特征区域是所述混合多重扩增引物以所述混合样品的核酸为模板的扩增产物，且所述非特征区域不为所述目标微生物类群的特征区域，若无所述非特征区域，则所述区分度＝3×L1/4，其中，L1为所述目标微生物类群的特征区域的核酸序列长度。具体地，在提取所述混合样品的核酸时，若所述待测样品中核酸的含量过低，则在提取所述混合样品的核酸的过程中，加入所述混合多重扩增引物不能扩增的外源核酸。具体地，所述目标微生物类群和所述目标微生物的定性分析方法如下：将所述高通量测序片段与每种所述目标微生物类群的特征区域进行比对，当差异碱基数≤n1时，则比对成功，相应的所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特征区域，其中，n1为所述目标微生物类群的特征测序片段的最大容错碱基数；若比对成功的所述目标微生物类群的特征区域≥1种时，则判断所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特征测序片段；将所述目标微生物的特征区域与每种同源的所述目标微生物类群的特征区域进行比对，在所述目标微生物的特征区域中提取差异碱基组成所述目标微生物的标准基因型；在所述目标微生物类群的特征测序片段上，提取所述目标微生物的标准基因型所对应的碱基，组成所述目标微生物的测试基因型；若所述目标微生物的测试基因型与所述目标微生物的标准基因型的差异碱基数≤n2，其中，n2为所述目标微生物的特征测序片段的最大容错碱基数，则所述目标微生物的测试基因型所在的所述高通量测序片段为所述目标微生物的特征测序片段；将所述参考微生物作为仅包含一个所述目标微生物的所述目标微生物类群，计算获得的所述目标微生物的特征测序片段，即为所述参考微生物的特征测序片段；若所述目标微生物类群的特征测序片段存在的概率P5≥α5，则判断所述待测样品中存在所述目标微生物类群，其中，α5为概率保障；若所述目标微生物类群的特征测序片段存在的概率P5<α5，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物类群；若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率P6≥α6，则判断所述待测样品中存在所述目标微生物，其中，α6为概率保障；若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率P6<α6，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物；n1使得P1≤α1且P3≤α3，其中，P1为一条不是所述目标微生物类群的特征测序片段的所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物类群的特征测序片段而产生的假阳性...

【技术保护点】
一种小麦微生物定性与定量的检测方法，其特征在于，所述方法包括：确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存在于所述待测样品中的参考微生物，所述待测样品为小麦；根据所述目标微生物类群、所述目标微生物、所述参考微生物和所述非目标生物的参考基因组序列，获得所述目标微生物类群的特征区域、所述目标微生物的特征区域和所述参考微生物的特征区域；制备扩增所述目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增所述目标微生物的特征区域的第二多重扩增引物和扩增所述参考微生物的特征区域的第三多重扩增引物，将所述第一多重扩增引物、所述第二多重扩增引物和所述第三多重扩增引物混合得到混合多重扩增引物；向所述待测样品中加入所述参考微生物，获得混合样品；提取所述混合样品的核酸；利用所述混合多重扩增引物和所述混合样品的核酸进行扩增反应，获得扩增产物；利用所述扩增产物进行高通量测序，获得高通量测序片段；根据所述高通量测序片段，对所述目标微生物类群和所述目标微生物进行定性和定量分析。

【技术特征摘要】
1.一种小麦微生物定性与定量的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存在于所述待
测样品中的参考微生物，所述待测样品为小麦；
根据所述目标微生物类群、所述目标微生物、所述参考微生物和所述非目标生物的参
考基因组序列，获得所述目标微生物类群的特征区域、所述目标微生物的特征区域和所述
参考微生物的特征区域；
制备扩增所述目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增所述目标微生物
的特征区域的第二多重扩增引物和扩增所述参考微生物的特征区域的第三多重扩增引物，
将所述第一多重扩增引物、所述第二多重扩增引物和所述第三多重扩增引物混合得到混合
多重扩增引物；
向所述待测样品中加入所述参考微生物，获得混合样品；
提取所述混合样品的核酸；
利用所述混合多重扩增引物和所述混合样品的核酸进行扩增反应，获得扩增产物；
利用所述扩增产物进行高通量测序，获得高通量测序片段；
根据所述高通量测序片段，对所述目标微生物类群和所述目标微生物进行定性和定量
分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标微生物类群的数目≥1个，且每个
所述目标微生物类群包括≥0种所述目标微生物；
所述目标微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体和原生
动物中的至少一种；
所述参考微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体和原生
动物中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述确定待测样品中的非目标生物的方法
包括：将所述非目标生物确定为除所述目标微生物类群之外的所有生物，若能获得所述目
标微生物类群的特征区域，则所述非目标生物指除所述目标微生物类群之外的所有生物；
若不能获得所述目标微生物类群的特征区域，则所述非目标生物指所述混合样品中，除所
述目标微生物类群之外的其它生物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标微生物类群的特征区域为所述目
标微生物类群内的微生物的参考基因组上的核酸序列；所述目标微生物类群的特征区域的
两侧的序列在所述参考基因组中为单一序列；所述目标微生物类群的特征区域的两侧的序
列在所述目标微生物类群内不同微生物间保守；所述目标微生物类群的特征区域的区分度
≥3；
所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群的特征区域同源；所述目标微生物
的特征区域的m2值≥2，其中，m2值为所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群内
除所述目标微生物外的其它所述微生物间的差异碱基数的最小值；
所述参考微生物的特征区域为所述参考微生物的参考基因组上的核酸序列；所述参考
微生物的特征区域的两侧的序列在所述参考微生物的参考基因组中为单一序列；所述参考
微生物的特征区域的两侧的序列在除所述参考微生物外的其它生物中不具有同源性。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述区分度是指由同一所述混合多重扩增
引物扩增的任一所述目标微生物类群的特征区域与任一非特征区域间的差异碱基数的最
小值，其中，所述非特征区域是所述混合多重扩增引物以所述混合样品的核酸为模板的扩
增产物，且所述非特征区域不为所述目标微生物类群的特征区域，若无所述非特征区域，则
所述区分度＝3×L1/4，其中，L1为所述目标微生物类群的特征区域的核酸序列长度。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
在提取所述混合样品的核酸时，若所述待测样品中核酸的含量过低，则在提取所述混
合样品的核酸的过程中，加入所述混合多重扩增引物不能扩增的外源核酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标微生物类群和所述目标微生物的
定性分析方法如下：
将所述高通量测序片段与每种所述目标微生物类群的特征区域进行比对，当差异碱基
数≤n1时，则比对成功，相应的所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特征区域，其
中，n1为所述目标微生物类群的特征测序片段的最大容错碱基数；若比对成功的所述目标
微生物类群的特征区域≥1种时，则判断所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特
征测序片段；
将所述目标微生物的特征区域与每种同源的所述目标微生物类群的特征区域进行比
对，在所述目标微生物的特征区域中提取差异碱基组成所述目标微生物的标准基因型；在
所述目标微生物类群的特征测序片段上，提取所述目标微生物的标...

【专利技术属性】
技术研发人员：张静，胡长峰，彭海，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42