以MIC-1 cDNA为模板制备RNA探针的方法技术

本发明专利技术涉及一种以MIC-1cDNA为模板制备RNA探针的方法。该方法包括：针对MIC-1mRNA序列筛选多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；从MIC-1cDNA质粒中，采用上述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针。本发明专利技术得到的cRNA探针能够全部覆盖所有靶序列，即MIC-1mRNA序列。本发明专利技术探针制备方法简化了探针制备步骤，大幅度缩短整个实验时间，探针特异性和稳定性更强，背景信号更低且灵敏度更高。在此基础上，本发明专利技术提供了一种快速检测肿瘤相关的MIC-1表达的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸诊断领域，具体涉及一种以MIC-1cDNA为模板制备RNA探针的方法及其应用。
技术介绍
荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)是一种重要的非放射性原位杂交技术，荧光染料标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA或RNA分子杂交，如果被检测的染色体靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而探针可以直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。通过在荧光显微镜下观察荧光信号，以确定与特异探针杂交后结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位，对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。荧光原位杂交技术(FISH)具有很多优点，无需放射性同位素标记，安全性较高；FISH的实验周期短，探针稳定性强；通过多次免疫化学反应，使其杂交信号放大，提高灵敏度，检测的灵敏度接近同位素探针杂交；FISH的分辨率高达3-20Mb；FISH可以用不同修饰核苷酸分子标记不同的探针，即可以制备成多色探针。FISH技术已经在基因定位、基因作图、基因扩增和缺失的检测、产前诊断、哺乳动物染色体进化研究等领域得到了广泛应用，特别是在肿瘤诊断方面，FISH技术被广泛用于乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤等实体瘤的早期诊断、疗效检测、个体化治疗和预后判断等几个方面。cRNA探针比cDNA探针有更多的优势：避免了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间易复性的可能性，提高了杂交反应的敏感性；cRNA与RNA之间形成的杂交体比cDNA-RNA杂交体更稳定；且cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响，因此杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针，可降低本底信号的影响。制备特异性强、灵敏度高和稳定性强的肿瘤检测探针，生产易保存和运输相关试剂及试剂盒，对肿瘤早期诊断和治疗至关重要。研发出用于诊断和治疗多种肿瘤的高品质探针及相关试剂盒，不仅能提高人民的健康水平，而且具有很大的经济效益、社会效益及广阔的市场前景。MIC-1(Macrophageinhibitorycytokine-1即巨噬细胞抑制细胞因子-1)是于1997年由克隆活化的巨噬细胞而发现的TGF-B超家族的新成员，被命名为MIC-1。人类基因组MIC-1基因包括2个外显子(309bp和891bp)和1个内含子(1820bp)基因定位于19p13.1。MIC-1蛋白编码308个氨基酸，其中包括29个氨基酸的信号引导肽(signalleaderpeptide)、167个氨基酸的前肽(propeptide)和112个氨基酸的成熟MIC-1蛋白(matinpeptide)MIC-1的主要功能和生物特征目前尚未完全明了，其在胎盘中大量表达，提示其可能与哺乳动物胎儿的发育有关；许多研究表明MIC-1的诱导产生与细胞周期停滞及细胞凋亡有关；其可能是巨噬细胞活性的自分泌调节物，促进肿瘤转移和增加肿瘤细胞的侵袭性。胎盘是唯一大量表达MIC-1的正常组织，前列腺、消化道及神经系统的上皮组织有少量MIC-lmRNA的表达；最近的研究表明在许多病理状态下，如炎症和肿瘤发生时，MIC-1的蛋白表达及血清水平会异常增高，提示MIC-1是参与多种应激反应的主要分泌因子并与恶性肿瘤的发生发展有关。研究表明许多恶性肿瘤的细胞株(如胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌)大量表达MIC-1，其在多种肿瘤组织中表达水平明显高于良性病变及正常组织。荧光原位杂交技术具有快速、准确和特异性强的特点，因此，研发和生产用于诊断和监测MIC-1mRNA水平的荧光原位杂交探针及试剂盒，具有很大的社会效益和广阔的市场前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用MIC-1cDNA为模板制备RNA探针的方法。本专利技术所述的以MIC-1cDNA为模板制备RNA探针的方法包括以下步骤：A.针对MIC-1mRNA序列筛选多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；B.从MIC-1cDNA质粒中，采用步骤A的所述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；C.加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针。根据本专利技术所述的以MIC-1cDNA为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶，引物的5'端加上T7启动子序列。根据本专利技术所述的以MIC-1cDNA为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是SP6RNA聚合酶，引物的5'端分别加上SP6启动子序列。根据本专利技术所述的以MIC-1cDNA为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是T3RNA聚合酶，引物的5'端分别加上T3启动子序列。根据本专利技术所述的以MIC-1cDNA为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是TrcRNA聚合酶，引物的5'端分别加上Trc启动子序列。T7启动子序列：5’-TAATACGACTCACTATAG-3′SP6启动子序列：5’-CATACGATTTAGGTGACACTATA-3′T3启动子序列：5’-AATTAACCCTCACTAAAG-3′Trc启动子序列：5’-TGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAAT-3′上述四种RNA聚合酶与相应启动子的组合为同类型的设计，可以替换使用。根据本专利技术所述的以MIC-1cDNA为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述步骤A中，所述筛选包括：筛选2-50个无内含子和重复序列的特定目标序列区域，根据需要可选择同源区域序列，作为靶序列。本专利技术还提供了一种快速检测肿瘤相关的MIC-1表达的试剂盒。本专利技术所述的试剂盒包括根据本专利技术所述的方法所制备的RNA探针。本专利技术所述的方法只用一步反应即可制备200-500nt理想长度的cRNA探针，并且可直接用于下一步的杂交试验，可以提高试验效率，节约检测时间。本专利技术所述的方法有利于筛选和制备高特异性探针，并可消除非编码RNA及非特异性信号的影响。本专利技术所述的方法制备的探针，其用途是生产在受试者样本中区分相关疾病样本和正常样本的试剂盒。本专利技术还提供了用于在受试者样本中区分相关疾病样本和正常样本的试剂盒。本专利技术所述的用于在受试者样本中区分相关疾本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以MIC‑1cDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.针对MIC‑1mRNA序列筛选多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；B.从MIC‑1cDNA质粒中，采用步骤A的所述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；C.加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针。

【技术特征摘要】
2016.02.05 CN 20161008258171.一种以MIC-1cDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，包括以
下步骤：
A.针对MIC-1mRNA序列筛选多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对
引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括
所有靶序列；
B.从MIC-1cDNA质粒中，采用步骤A的所述引物，通过PCR扩增得到
所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；
C.加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，
纯化后得到RNA探针。
2.根据权利要求1所述的以MIC-1cDNA为模板制备RNA探针的方法，其
特征在于，所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶，引物的5'端加上T7启动子序
列。
3.根据权利要求1所述的以MIC-1cDNA为模板...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐学明，鲁隼，冯俊清，
申请(专利权)人：广州复能基因有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44