本发明专利技术涉及一种人重组乙型干扰素融合蛋白。所述人重组乙型干扰素融合蛋白为人乙型干扰素与抗人血清白蛋白重链单域抗体的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述抗人血清白蛋白重链单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术通过构建抗人血清白蛋白的重链单域抗体与乙型干扰素融合表达克隆，导入到宿主细胞进行表达，获得具有较长作用时间的重链单域抗体‑乙型干扰素融合蛋白。
【技术实现步骤摘要】
一种人重组乙型干扰素融合蛋白本申请是申请日为2014年4月9日、中国申请号为201410140796.0、专利技术名称为“一种人重组乙型干扰素融合蛋白”的专利技术申请的分案申请。
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种人重组乙型干扰素融合蛋白。
技术介绍
乙型干扰素(又称为β干扰素，Interferon-β，IFN-β)是由体内纤维细胞和巨噬细胞分泌的细胞因子，是一种糖蛋白，含166个氨基酸，分子量约为20,500道尔顿，具有抗炎症功能，抗病毒、抗增殖以及免疫调节活性，其作为药物可广泛用于抗感染、抗肿瘤和拮抗自身免疫性疾病。然而，乙型干扰素血浆半衰期短，只有频繁给药才能获得令人满意的疗效。但如此频繁给药再加上较长的治疗周期，使得病人难以承受，迫切需要研制作用时间长的乙型干扰素。人血清白蛋白(HSA)是人体血液中天然的物质输送载体，血清中含量最高，其相对分子量约为65kDa，由585个氨基酸组成的单链球型蛋白质，无酶学及免疫学活性，体内半衰期长达19天。骆驼和鲨鱼类动物体内存在着天然缺失轻链的重链抗体(heavy-chainantibody，HCAb)，这种抗体只包含一个重链可变区(variabledomainofheavychainofHCAb，VHH)和两个常规的CH2与CH3区，单独克隆并表达出来的VHH区，称为重链单域抗体，具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，分子量只有15kDa，可溶性极高，不易聚集，能耐高温等致变性条件。噬菌体表面呈现技术是一种应用最广泛的抗体库技术，该技术通过构建抗体文库，然后将抗体基因表达于噬菌体表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，能够获得高度特异性的抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重组乙型干扰素融合蛋白，该融合蛋白具有较长的半衰期。本专利技术所述的一种人重组乙型干扰素融合蛋白，为人乙型干扰素与抗人血清白蛋白重链单域抗体的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术所述的融合蛋白的进一步特征，所述抗人血清白蛋白重链单域抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术采用羊驼作为免疫动物，运用噬菌体表面呈现技术，从免疫羊驼外周血收集淋巴细胞，构建了库容量为5×107的抗人血清白蛋白(HSA)重链抗体文库。通过HSA筛选，获得1株抗HSA的重链抗体。克隆该抗体的VHH获得重链单域抗体，然后构建重链单域抗体与乙型干扰素融合表达克隆，导入到宿主细胞进行表达，获得具有较长作用时间的重链单域抗体-乙型干扰素融合蛋白。附图说明图1为在酵母细胞重组表达重链单域抗体-人乙型干扰素融合蛋白流程图。图2为pPicZα-6His-Zipper1-CTHS-VHH-IFN转化酵母菌后，挑取4单菌落的诱导表达结果。图3为重链单域抗体-人乙型干扰素融合蛋白细胞病变抑制结果。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，目的在于解释本专利技术的内容而非限制专利技术的保护范围。下面实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等人著，分子克隆：试验指南(NewYork，ColdSpringHabourLaboratoryPress)中所述条件，或按照制造厂商建议条件进行。1.抗HSA重链单域抗体(VHH)的筛选(1)羊驼的免疫用人血清白蛋白(HSA)免疫两只羊驼，免疫方案如下：免疫羊驼抗原用量：0.5mg，0.5mg，1.0mg，1.0mg，2.0mg，2.0mg，4.0mg，4.0mg。免疫间隔时间：2周。免疫方法：第一次免疫：抗原加弗式完全佐剂研磨混匀，皮下多点注射。后续免疫：抗原加弗式不完全佐剂，皮下多点注射，0.5ml/点，4点/次。每次免疫前取少量血，用ELISA方法检测羊驼血中抗HSA抗体的滴度。(2)抗HSA免疫噬菌体抗体库的构建收集免疫羊驼外周血，分离淋巴细胞，提取总RNA，反转录合成cDNA。用特异性引物，采用巢氏PCR方法扩增重链可变区片段。构建库容量为5×107的抗HSA免疫噬菌体抗体库，酶切鉴定重组率为90％。第一轮PCR引物：5’引物：5’-GATGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGRGGAGG-3’SEQIDNO.35’-GTCCTGGCTCTCTTCTACAAGG-3’SEQIDNO.43’引物：5’-CGCCATCAAGGTACCAGTTGA-3’SEQIDNO.55’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’SEQIDNO.6第二轮PCR引物：5’引物：5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTGTGG-3’SEQIDNO.75’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTRCAGCTGGTGGAGTCTGG-3’SEQIDNO.85’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGG-3’SEQIDNO.95’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3’SEQIDNO.105’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCGTGCAGCTGGTGGATTCTGG-3’SEQIDNO.115’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3’SEQIDNO.123’引物：5’-GGACTAGTGCGGCCGCGTGAGGAGACGGTGACCTG-3’SEQIDNO.135’-GGACTAGTGCGGCCGCTATGAGGAGACGGTGACCTG-3’SEQIDNO.14第一轮PCR反应条件：94℃5分钟预变性，94℃30秒，56℃30秒，72℃50秒，35个循环，72℃10分钟。第二轮PCR反应条件：94℃5分钟预变性，94℃30秒，56℃30秒，72℃50秒，30个循环，72℃10分钟。(3)抗HSA免疫噬菌体抗体库的富集筛选筛选抗原为HSA，用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗原，浓度为5μg/ml，取2ml包被免疫试管，对抗体库进行3轮富集筛选后，用噬菌体-ELASA方法筛选阳性克隆。(4)抗HSA免疫噬菌体抗体库的筛选挑选192个富集筛选后的单菌落，37℃振摇过夜。然后按1∶100转接于新鲜200ul2YTGA中，37℃振摇2.5小时，M13K07超感染。3,500rpm，10min收集菌体，然后用200ul2YTGAK重悬细菌沉淀。30℃振摇过夜，次日11,000rpm离心15min，取上清进行鉴定。用HSA包被ELISA板，加入上本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人重组乙型干扰素融合蛋白，为人乙型干扰素与抗人血清白蛋白重链单域抗体的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种人重组乙型干扰素融合蛋白，为人乙型干扰素与抗人血清白蛋白重链单域抗体的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
【专利技术属性】
技术研发人员：李华平，张金阔，钱柳青，范名俊，朱苗苗，
申请(专利权)人：广州复能基因有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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