α-螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽及制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种α‑螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽及其制备方法与应用，其包含促凋亡功能肽段、肿瘤靶向功能肽段、转角氨基酸残基及含硫醚分子骨架，促凋亡肽段为富含赖氨酸和亮氨酸的两亲性序列，转角氨基酸为脯氨酸，所述含硫醚分子骨架通过巯基‑炔基点击化学将两分子巯基丙酸加成到含炔基非天然氨基酸侧链，并通过大环内酰胺化获得。该多肽的制备方法简单有效，且通过在促凋亡肽功能肽段的第i个和i+7个氨基酸残基位置进行双环化，可以显著提高环化效率，与线性多肽相比，双环多肽α‑螺旋程度更高，稳定性更强，血液稳定性良好，此外，该双环多肽可分别靶向细胞表面整合素受体以及细胞内线粒体，选择性扰乱整合素高表达肿瘤细胞线粒体膜电位，该促凋亡双环多肽具有良好的肿瘤治疗应用前景。

【技术实现步骤摘要】
α-螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽及制备方法与应用
本专利技术属于生物医药领域，尤其是涉及一种α-螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽及制备方法与应用。
技术介绍
促凋亡肽KLA(KLAKLAKKLAKLAK)是一段具有抗菌活性的α-螺旋两亲性多肽，可靶向线粒体并破坏线粒体膜，导致细胞色素C的释放从而诱导细胞凋亡，其被广泛报道可用于恶性肿瘤的治疗。但线性KLA多肽存在稳定性差、细胞穿透性差、细胞活性差等问题。目前文献报道主要通过偶联配体，利用受体介导的胞吞作用将促凋亡肽KLA递送到胞内。例如通过在促凋亡肽KLA序列中进一步修饰环状NGR多肽配体，AHNP多肽配体或者通过叶酸实现。因此，促凋亡肽KLA可以有效靶向细胞线粒体，破坏线粒体膜，从而引起细胞色素C的释放，激活细胞的凋亡通路，最终用于恶性肿瘤的治疗，因此促凋亡多肽类药物逐渐成为研究的热点。在多肽类药物相对于小分子药物的优势存在下，但传统多肽类药物依然存在各种各样的问题，比如线性多肽稳定性差，细胞穿透能力差、具有功能性的多肽没有靶向、有靶向性的多肽没有功能性、只能单一地靶向细胞内或者细胞表面的受体等等这些缺点。因此针对多肽类药物的缺点进行修饰与改性依然是巨大的挑战。
技术实现思路
本专利技术解决了传统多肽代谢稳定性差、细胞穿透能力不高以及靶向性不强的技术问题。申请人在前期的研究中开发了多种新型多肽稳定体系，发现通过化学环化作用可以有效提高多肽的稳定性，同时增强多肽的细胞穿透能力，提高多肽的活性，同时不同侧链化学修饰也可以显著影响多肽的构象，两亲性等生物物理性质，但该这类单环多肽缺乏肿瘤靶向性，基于上述研究结果，申请人进一步通过光引发巯基-炔点击化学构建了含硫醚侧链的具有双靶向能力的α-螺旋构象稳定双环多肽。按照本专利技术的第一方面，提供了一种α-螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽，该促凋亡双环多肽具有稳定的α-螺旋二级结构，其包含促凋亡功能肽段、肿瘤靶向功能肽段、转角氨基酸残基及含硫醚分子骨架，所述促凋亡功能肽段和肿瘤靶向功能肽段之间通过转角氨基酸残基连接并利用连接分子形成含硫醚分子骨架的双环结构。优选地，所述连接分子为巯基丙酸、巯基乙酸或巯基丁酸中的任一种。优选地，所述转角氨基酸残基为脯氨酸或甘氨酸中的任一种，脯氨酸和甘氨酸为大多数蛋白质转角氨基酸，这种转角功能可以提供促凋亡肽段和靶向肽段间的柔性。优选地，所述肿瘤靶向功能肽段为靶向αvβ3整合素的RGD序列、靶向生长抑素受体奥曲肽fCYwKTCT序列、兰瑞肽序列D-2-Nal-CYwKVCT序列以及靶向Her2受体的多肽序列YCDGFYACYMDV序列中的任一种。优选地，所述含硫醚分子骨架位于促凋亡功能肽段序列中第i个氨基酸位置，所述双环结构的环化位置分别以该含硫醚侧链的氨基酸残基为起始，与多肽C端方向i+4位、i+7位或i+11位氨基酸残基侧链成环以及与多肽N末端氨基酸残基成环形成双环分子骨架。利用i和i+4、i和i+7、i和i+11的位置进行环化，可以显著提高环化效率，因为在α-螺旋结构的多肽序列中，第i与i+4、i+7、i+11位置的氨基酸侧链处在螺旋的同一侧上。优选地，所述促凋亡双环多肽的结构如式1所示：或，所述促凋亡双环多肽的结构如式2所示：按照本专利技术的另一方面，提供一种α-螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽的制备方法，具体制备过程如下：S1.采用Fmoc固相多肽合成技术合成线性多肽序列Fmoc-WRGDfVPKLAKLXKKLAKLK(Alloc)K-Resin，其中，X为带炔基侧链的非天然氨基酸；S2.对线性肽序列Fmoc-WRGDfVPKLAKLXKKLAKLK(Alloc)K-Resin末端的色氨酸脱除Fmoc基团后得到线性多肽；S3.利用光引发巯基-炔点击化学反应形成含硫醚侧链分子骨架前体：在步骤S2获得的1当量线性多肽产物中，加入2当量光引发剂2,2-二羟甲基丙酸DMPA，4当量巯基丙酸，在365nm紫外光灯下照射反应2h；S4.利用步骤S3的反应产物进行大环内酰胺化构建含硫醚结构的双环骨架；S5.将环化后的多肽从树脂上切割下来，利用高效液相色谱纯化后冷冻干燥获得目标双环多肽。优选地，步骤S5中，采用2.5％H2O，2.5％TIS和95％TFA组成的切割液将多肽从树脂上切割下来。按照本专利技术的另一方面，提供上述的α-螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽在肿瘤治疗方面的应用。总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的有益效果：(1)创造性地构建具有治疗性和靶向性的双重功效的含硫醚结构的双环多肽骨架，同时该双环多肽具有稳定的α-螺旋二级构象；通过结合具有改变线粒体膜通透性来破环线粒体从而促进细胞凋亡的促凋亡肽段与具有靶向肿瘤细胞过表达的αvβ3整合素的RGD肽段，在同一多肽骨架中实现了双重靶向功能；同时，利用巯基炔点击化学形成含硫醚双环分子骨架具有低非特异性毒性并可以进一步增加多肽的稳定性以及细胞穿透能力。(2)创造性地利用光照反应合成含硫醚键分子骨架的双环多肽，且通过在促凋亡肽段的第i和i+4或第i和i+7或第i和i+11个氨基酸残基位置进行双环化，可以显著提高环化效率，环化效率可达80％。(3)所构建的双环多肽相对于线性多肽α-螺旋程度更高，具有良好的α-螺旋稳定性，且溶血率较低具有良好的血液稳定性和低非特异性细胞毒性，且相比于线性多肽，双环多肽对于整合素高表达的肿瘤细胞表现出更明显的线粒体杀伤能力，而对正常细胞杀伤能力较小，具有良好的肿瘤治疗应用前景。附图说明图1为具有α-螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽的合成路线图。图2为纯化后的线性多肽的液相图。图3为纯化后的双环多肽Cyclic的液相图。图4为从两个异构体分离出来后Cyclic-1的液相图。图5为从两个异构体分离出来后Cyclic-2的液相图。图6为纯化后的线性多肽的质谱图。图7为从两个异构体分离出来后Cyclic-1的质谱图。图8为从两个异构体分离出来后Cyclic-2的质谱图。图9为线性多肽与双环多肽Cyclic-1、Cyclic-2的圆二色谱图。图10为不同浓度的线性多肽与双环多肽Cyclic的溶血率统计图。图11为线性多肽和双环多肽与不同细胞培养的细胞毒性统计图。图12为线性多肽和双环多肽与4T1共孵育的荧光显微图。图13为线性多肽和双环多肽与MCF-7共孵育的荧光显微图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合说明书附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。实施例1本实施例提供一种α-螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽，包含促本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种α-螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽，其特征在于，该促凋亡双环多肽具有稳定的α-螺旋二级结构，其包含促凋亡功能肽段、肿瘤靶向功能肽段、转角氨基酸残基及含硫醚分子骨架，所述促凋亡功能肽段和肿瘤靶向功能肽段之间通过转角氨基酸残基连接并利用连接分子形成含硫醚分子骨架的双环结构。/n

【技术特征摘要】
1.一种α-螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽，其特征在于，该促凋亡双环多肽具有稳定的α-螺旋二级结构，其包含促凋亡功能肽段、肿瘤靶向功能肽段、转角氨基酸残基及含硫醚分子骨架，所述促凋亡功能肽段和肿瘤靶向功能肽段之间通过转角氨基酸残基连接并利用连接分子形成含硫醚分子骨架的双环结构。


2.如权利要求1所述的一种α-螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽，其特征在于，所述连接分子为巯基丙酸、巯基乙酸或巯基丁酸中的任一种。


3.如权利要求1所述的一种α-螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽，其特征在于，所述转角氨基酸残基为脯氨酸或甘氨酸中的任一种。


4.如权利要求1所述的一种α-螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽，其特征在于，所述肿瘤靶向功能肽段为靶向αvβ3整合素的RGD序列、靶向生长抑素受体奥曲肽fCYwKTCT序列、兰瑞肽序列D-2-Nal-CYwKVCT序列以及靶向Her2受体的多肽序列YCDGFYACYMDV序列中的任一种。


5.如权利要求4所述的一种α-螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽，其特征在于，所述含硫醚分子骨架位于促凋亡功能肽段序列中第i个氨基酸位置，所述双环结构的环化位置分别以该含硫醚侧链的氨基酸残基为起始，与多肽C端方向i+4位、i+7位或i+11位氨基酸残基侧链成环以及与多肽N末端氨基酸残基成环形成双环分子骨架。


6.如权利要求5所述的一种α-螺旋构象稳定的促凋亡双环多肽，...

【专利技术属性】
技术研发人员：田原，唐瑞，
申请(专利权)人：西南交通大学，
类型：发明
国别省市：四川;51