一种降低脱靶效应的RNA基因编辑系统的制备方法技术方案

本发明专利技术涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种降低脱靶效应的RNA基因编辑系统的制备方法。本发明专利技术提供的一种融合蛋白，自N端至C端依次包括Cas13b蛋白的氨基酸序列、ADAR2蛋白的氨基酸序列和具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列；上述融合蛋白应用到RNA基因编辑系统如RESCUE系统中，通过在碳端融合具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列，具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列可以结合TMP调控dRanCas13b表达Cas13b蛋白与hADAR2表达ADAR2蛋白，在不影响编辑效率的前提下，显著减少RNA编辑过程中脱靶SNP数量，进而提高RNA单碱基编辑系统应用安全性。

【技术实现步骤摘要】
一种降低脱靶效应的RNA基因编辑系统的制备方法
本专利技术涉及基因编辑
，具体涉及一种降低脱靶效应的RNA基因编辑系统的制备方法。
技术介绍
CRISPR-Cas9系统介导的基因编辑技术为人类单碱基突变疾病的修复提供了新的方向与思路。目前的主要单碱基编辑工具，包括CBE(Komoretal.,2016；Nishida,Ketal.,2016；Li,Xetal.,2018),ABE(Gaudelli,N.Metal.,2017),PE(AnzaloneAVetal.,2019)等可以进行DNA的单碱基编辑，修正疾病突变SNP，已经成为一种潜在的基因治疗技术。但是DNA的单碱基编辑是一种永久性的变化。相比之下，RNA编辑可以进行临时修复，消除蛋白质中的突变，停止它们的产生，或者改变它们在特定器官和组织中的工作方式。因为细胞会迅速降解未使用的核糖核酸，所以治疗带来的任何错误都会被清楚，而不是永远存在。目前，介导RNA单碱基编辑的工具主要有两类，第一类为介导A>G编辑的REPAIR系统(CoxDBTetal.,2017)，CRISPR-Cas13b系统能把ADAR2送到RNA上的某个特异位点，把腺嘌呤转化为肌苷。在细胞看来，肌苷与鸟嘌呤别无二致，因此就能按鸟嘌呤处理，合成具有正常生理功能的蛋白质。这套系统被命名为“可编程的腺嘌呤到肌苷RNA编辑”(RNAEditingforProgrammableAtoIReplacement,REPAIR)。在REPAIR的基础上，张锋团队开发出了既能介导A>G编辑，也能介导C>U编辑的RESCUE系统(AbudayyehOOetal.,2019)，其利用dCas13引导RESCUE有针对性地靶向转录RNA中的胞嘧啶碱基(C)，并使用一种改进后的全新ADAR2酶把不需要的胞嘧啶碱基(C)精确地修改为尿嘧啶碱基(U)，从而改变RNA的指令，达到不修改DNA也可实现改变蛋白质的目的。RESCUE系统极大扩展了CRISPR技术在RNA编辑领域的应用，包括蛋白质中可修改的特定位置，比如磷酸化位点。这些位点在蛋白质的功能中起着决定性的作用，在信号分子和癌症相关通路中尤为明显。但目前的RNA编辑系统在脱靶方面仍存在缺陷，严重影响了该工具应用的安全性。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术中的RNA编辑系统在脱靶事件方面仍存在缺陷，严重影响了该工具应用的安全性，从而提供一种融合蛋白、基因编辑系统及其应用，所述融合蛋白应用于RNA基因编辑系统可显著减少脱靶数量，基因编辑更加精准和安全。为此，本专利技术提供了如下的技术方案：一种融合蛋白，自N端至C端依次包括Cas13b蛋白的氨基酸序列、ADAR2蛋白的氨基酸序列和具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列。所述的融合蛋白中，编码具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1中第6149位-6619位。所述的融合蛋白中，还包括报告基团蛋白氨基酸序列；可选的，所述融合蛋白，自N端至C端依次包括Cas13b蛋白的氨基酸序列、ADAR2蛋白的氨基酸序列、报告基团蛋白氨基酸序列和具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列；可选的，所述报告基团蛋白为mCherry蛋白；可选的，所述融合蛋白还包括NES氨基酸序列；可选的，所述融合蛋白，自N端至C端依次包括Cas13b蛋白的氨基酸序列、NES氨基酸序列、ADAR2蛋白的氨基酸序列、报告基团蛋白氨基酸序列和具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列；生物材料，包括如下任意一种：1)编码所述的融合蛋白的核酸分子；可选的，所述核酸分子为DNA或RNA；可选的，所述DNA包括DNA分子、cDNA、基因组DNA或重组DNA；可选的，所述RNA为mRNA或hnRNA；可选的，如SEQIDNO.1所示的第926位-6619位的DNA分子或cDNA；2)表达所述的融合蛋白的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；3)含1)所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；4)含2)或3)中所述的表达盒的重组载体、重组微生物或转基因细胞系；5)含2)或3)或4)中所述的重组载体的重组微生物或转基因细胞系。本专利技术提供了所述的融合蛋白或所述的生物材料在基因编辑或制备基因编辑工具中的用途；可选的，所述基因编辑为RNA基因编辑；可选的，在提高RNA基因编辑安全性中的用途；可选的，在降低RNA基因编辑中脱靶效应的用途；可选的，所述RNA基因编辑为RNA单碱基基因编辑；可选的，所述RNA基因编辑为真核生物RNA单碱基基因编辑；可选的，所述真核生物包括真核细胞。本专利技术提供了一种RNA基因编辑系统，包括所述的融合蛋白；可选的，所述RNA基因编辑系统为表达所述的融合蛋白的重组载体、重组微生物或转基因细胞系；可选的，还包括sgRNA；可选的，还包括sgRNA的表达载体。本专利技术提供了一种所述的RNA基因编辑系统的制备方法，包括：编码具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列的核苷酸序列记为ecDHFRDD核酸序列；将ecDHFRDD核酸序列构建到含有RNA基因编辑系统表达元件dRanCas13b与hADAR2的表达载体中，且ecDHFRDD核酸序列与表达元件dRanCas13b与hADAR2位于同一表达盒内，所述ecDHFRDD核酸序列位于hADAR2的C端，构建得到的表达载体记为ecRESCUE表达载体。所述的制备方法中，所述含有RNA基因编辑系统表达元件dRanCas13b与hADAR2的表达载体为RESCUERNA编辑系统的表达载体；可选的，所述的RESCUERNA编辑系统的表达载体为真核表达载体；可选的，所述含有dRanCas13b与hADAR2表达元件的表达载体为在dRanCas13b的C端连有NES序列的载体；可选的，所述NES序列的C端连有报告基团的核酸序列；可选的，报告基团的核酸序列为mCherry的核酸序列；可选的，报告基团的核酸序列的C端连有ecDHFRDD核酸序列。所述的制备方法中，所述ecDHFRDD核酸序列如如SEQIDNO.1中第6149位-6619位；可选的，所述ecDHFRDD的mRNA序列5’端具有帽子结构，且3’端具有多聚腺嘌呤核苷酸尾结构；可选的，还包括sgRNA表达载体；可选的，所述sgRNA表达载体为pC0041-RanCas13bcrRNAbackbone哺乳基因编辑质粒。本专利技术提供了一种RNA基因编辑方法，包括利用所述的基因编辑系统或制备的基因编辑系统；可选的，在对细胞的内源基因的转录本进行编辑时，将ecRESCUE表达载体和sgRNA表达载体导入真核细胞中后进行培养，然后加入TMP，继续培养细胞；可选的，加入的TMP的终浓度为2ng/uL；可选的，导入真核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，自N端至C端依次包括Cas13b蛋白的氨基酸序列、ADAR2蛋白的氨基酸序列和具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，自N端至C端依次包括Cas13b蛋白的氨基酸序列、ADAR2蛋白的氨基酸序列和具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，编码具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1中第6149位-6619位。


3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，还包括报告基团蛋白氨基酸序列；
可选的，所述融合蛋白，自N端至C端依次包括Cas13b蛋白的氨基酸序列、ADAR2蛋白的氨基酸序列、报告基团蛋白氨基酸序列和具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列；
可选的，所述报告基团蛋白为mCherry蛋白；
可选的，所述融合蛋白还包括NES氨基酸序列；
可选的，所述融合蛋白，自N端至C端依次包括Cas13b蛋白的氨基酸序列、NES氨基酸序列、ADAR2蛋白的氨基酸序列、报告基团蛋白氨基酸序列和具有二氢叶酸还原酶活性的氨基酸序列。


4.生物材料，其特征在于，包括如下任意一种：
1)编码权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的核酸分子；可选的，所述核酸分子为DNA或RNA；可选的，所述DNA包括DNA分子、cDNA、基因组DNA或重组DNA；可选的，所述RNA为mRNA或hnRNA；可选的，如SEQIDNO.1所示的第926位-6619位的DNA分子或cDNA；
2)表达权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；
3)含1)所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；
4)含2)或3)中所述的表达盒的重组载体、重组微生物或转基因细胞系；
5)含2)或3)或4)中所述的重组载体的重组微生物或转基因细胞系。


5.权利要求1-3任一项所述的融合蛋白或权利要求4所述的生物材料在基因编辑或制备基因编辑工具中的用途；
可选的，所述基因编辑为RNA基因编辑；
可选的，在提高RNA基因编辑安全性中的用途；
可选的，在降低RNA基因编辑中脱靶效应的用途；
可选的，所述RNA基因编辑为RNA单碱基基因编辑；
可选的，所述RNA基因编辑为真核生物RNA单碱基基因编辑；
可选的，所述真核生物包括真核细胞。


6.一种RNA基因编辑系统，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的融合蛋白；
可选的，所述RNA基因编...

【专利技术属性】
技术研发人员：马旭，王译晗，高建恩，
申请(专利权)人：国家卫生健康委科学技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11