一种融合酶及所述融合酶在纸基生物传感器中的应用制造技术

技术编号:28607940 阅读:29 留言:0更新日期:2021-05-28 16:01
本发明专利技术具体涉及一种融合酶及所述融合酶在纸基生物传感器中的应用。以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH)具有良好的稳定性,开发成为便携式葡萄糖传感器具有良好的应用前景。本发明专利技术提供了一种黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖型葡萄糖脱氢酶(GDH)基因与碳水化合物结合模块(CBM)基因构建的GDH‑linker‑CBM融合酶,通过碳水化合物结合模块及连接肽的修饰作用,将其制备成为一种纸基传感器,有效的提高了纸基传感器的酶活力、检测灵敏度及抗干扰能力,具有良好的市场开发前景。

【技术实现步骤摘要】
一种融合酶及所述融合酶在纸基生物传感器中的应用
本专利技术属于生物酶基因工程和生物传感
,具体涉及一种黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖型葡萄糖脱氢酶(GDH)基因与碳水化合物结合模块(CBM)基因构建的GDH-linker-CBM融合酶以及所述融合酶在纸基生物传感器中应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。严格控制生理血糖浓度是糖尿病患者避免危及生命的并发症的唯一途径,因此血糖监测是糖尿病管理的重要组成部分。目前在医疗保健基础设施完善的发达国家,通过血糖自我监测进行血糖控制已成为对公众经济、有效的途径,但在许多资源匮乏的国家,由于缺乏实验室基础设施和训练有素的专业人员,许多致命疾病都无法应付,糖尿病护理通常得不到优先考虑。因此,开发简单、低成本、易于操作、便携式的葡萄糖传感器成为迫切需要。近年来,基于纸张的微流体体系在开发简单、低成本、便携式的葡萄糖检测设备中受到了相当多的关注。其优势包括:(1)氧化还原酶可以通过物理吸附直接固定到纸基质中;(2)许多微流体元件可以集成在具有复杂的3D微流体通道的纸上;(3)多种多样的电极材料可以很容易地通过丝网印刷到纸上,且不需要昂贵的洁净室设施。用于血糖监测的葡萄糖传感器通常采用葡萄糖氧化酶作为生物识别元件,而葡萄糖氧化酶易受氧分压的影响,在检测静脉血、动脉血、高海拔等氧气含量差异明显的样本局限性较大。以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH)不以氧气为电子受体,且酶活性高、底物专一性强、稳定性好,成为用于开发便携式葡萄糖传感器的研究热点酶分子。但是目前GDH通常是利用物理吸附或共价结合等方式随机固定在电极表面,酶分子活性中心常被隐藏掉或不能正确取向,导致酶活大量损失,便携式葡萄糖传感器检测灵敏度较差。近年来,利用生物亲和吸附进行酶的固定化引起越来越多的关注,其最大优势是酶分子可与载体材料特异性结合、固定化方向可控以及酶分子构象改变最小。碳水化合物结合模块(Carbohydrate-BindingModules,CBM)是天然碳水化合物活性酶分子,自身没有催化活性,但能对纤维素等多糖具有结合特异性的结构域。随着分子生物学、合成生物学、计算机辅助模拟等技术发展,目前研究者利用融合DNA技术试图获得多种多样CBM与酶分子融合蛋白,以此提高酶分子与底物亲和力、酶分子稳定性或酶活。但利用CBM对纤维素的特异亲和吸附特性构建融合酶,并以纸基作为融合酶分子固定化载体,提高酶电极传感器检测灵敏性的改造策略目前国内外几乎未见报道。
技术实现思路
针对以上研究现状,专利技术人认为,提供一种基于葡萄糖脱氢酶的纸基传感器有助于获得一种性能优良的血糖监测设备,是一种前景良好的改造方向。基于该研究思路,本专利技术利用CBM对纤维素的特异亲和吸附特性构建融合酶,并以纸基作为融合酶分子固定化载体。经测定,该优化后的融合酶不仅能够与纸基载体表现出良好的亲和力,还能够从多个方面提高酶电极传感器的检测灵敏性。基于上述技术效果,本专利技术提供以下技术方案:本专利技术第一方面,提供一种融合酶,所述融合酶包括葡萄糖脱氢酶(GDH)肽段和碳水化合物结合模块(CBM)肽段,两部分通过柔性肽链连接。基于上述设计思路,本专利技术得到了一种融合酶,通过碳水化合物结合模块(CBM)的连接作用,能够有效的增加葡萄糖脱氢酶与纤维素纸基的结合力,有望获得一种检测灵敏性更高的纸基传感器。进一步的,经本专利技术的验证,上述设计思路获得的融合酶不仅能够获得良好的酶活力稳定性,其制备得到的纸基生物传感器的检测灵敏性也得到了明显的提升,并且生物样品中包括抗坏血酸、尿酸、尿素在内的常见干扰物均不会影响上述传感器的检测效果。基于该研究结果,将上述融合酶应用于纸基生产传感器的开发,有望获得检测性能更加优良的血糖、尿糖等检测产品。本专利技术第二方面,提供第一方面所述融合酶在制备葡萄糖检测元件中的应用。所述葡萄糖检测元件进一步的为纸基生物传感元件。纸基葡萄糖检测设备具有组装简单,使用便携的优点。传统的葡萄糖氧化酶检测元件受氧分压的影响,对氧气含量差异明显的样本检测具有很大局限性,并且葡萄糖氧化酶通常采用物理吸附或共价结合的方式进行固定,这种固定方式并不稳定,会导致酶分子活性中心受到影响,酶活也随之降低。而本专利技术提供的上述融合酶,采用黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH)作为酶元件,可以排除氧分压对测定结果的影响。另外,上述葡萄糖脱氢酶(GDH)与碳水化合物结合模块结合后与纸基能够获得更好的结合能力,有效的降低了传统葡萄糖氧化酶与载体脱离、酶活降低的概率。本专利技术第三方面,提供一种纸基生物传感元件,所述传感元件为固定第一方面所述融合酶的纤维素纸。本专利技术第四方面,提供一种血糖检测试剂盒,所述试剂盒中包括第一方面所述融合酶的固定化载体和/或第三方面所述纸基生物传感元件。以上一个或多个技术方案的有益效果是:目前利用CBM对纤维素的特异亲和吸附特性构建融合酶,并以纸基作为融合酶分子固定化载体,提高酶电极传感器检测灵敏性的改造策略目前国内外几乎未见报道。本专利技术首次提供了该融合酶的优异性能,基于该融合酶对纤维素结合特异性的发掘,本领域技术人员可以方便获得多种性能更加优良的葡萄糖水平监测产品,这对临床样品中葡萄糖水平监测及糖尿病的防治等均具有重要意义。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解,本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术,并不构成对本专利技术的不当限定。图1为SDS-PAGE检测异源表达的葡萄糖脱氢酶;其中(a)为预测的野生型葡萄糖脱氢酶(GDH)结构;(b),(c),(d)为预测的融合葡萄糖脱氢酶(GDH-NL-CBM2,GDH-(GGGGS)2-CBM2,GDH-(EAAAK)3-CBM2)结构;(c)条带M:蛋白标准物,20mM咪唑洗脱GDH的SDS-PAGE检测图谱;(d)10mM咪唑洗脱GDH-NL-CBM2的SDS-PAGE检测图谱;(e)超滤浓缩GDH和GDH-NL-CBM2的SDS-PAGE检测图谱。图2为GDH和GDH-NL-CBM2最适温度、最适pH测定;(a)为最适pH测定结果图;(b)为最适温度测定结果图。图3为固定GDH-NL-CBM2的纤维素纸基生物传感器模式图。图4为GDH和GDH-NL-CBM2/纤维素纸基生物传感器在PBS和不同浓度葡萄糖溶液中的电化学性能检测结果;(a),(b)分别为GDH和GDH-NL-CBM2循环伏安检测曲线;(c),(d)分别为GDH和GDH-NL-CBM2计时电流检测曲线;(e)为GDH和GDH-NL-CBM2对葡萄糖的线性响应分析。具体实施方式应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指本文档来自技高网
...

【技术保护点】
1.一种融合酶,其特征在于,所述融合酶包括葡萄糖脱氢酶肽段和碳水化合物结合模块肽段,两部分通过柔性肽链连接。/n

【技术特征摘要】
1.一种融合酶,其特征在于,所述融合酶包括葡萄糖脱氢酶肽段和碳水化合物结合模块肽段,两部分通过柔性肽链连接。


2.如权利要求1所述融合酶,其特征在于,所述葡萄糖脱氢酶肽段来源于AspergillusnigerAn76;
优选的,所述GDH的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示,或与SEQIDNO:1所示氨基酸序列具有80%及以上相似度、具有同样功能的氨基酸序列也在本发明请求保护的范围之内;
进一步的,SEQIDNO:1所示氨基酸序列的编码基因,其序列如SEQIDNO:2所示;除该基因序列外,还包括由于密码子简并性同样能够翻译得到SEQIDNO:1所示氨基酸序列的基因序列。


3.如权利要求1所述融合酶,其特征在于,所述碳水化合物结合模块肽段选自CBM1、CBM2、CBM3、CBM5、CBM10中的一种。


4.如权利要求3所述融合酶,其特征在于,所述碳水化合物结合模块为第2家族CBM,所述CBM2的序列如SEQIDNO:3所示,或与SEQIDNO:3所示氨基酸序列具有80%及以上相似度、具有同样功能的氨基酸序列;
优选的,还提供SEQIDNO:3所示氨基酸序列的编码基因,其序列如SEQIDNO:4所示;除该基因序列外,还包括由于密码子简并性同样能够翻译得到SEQIDNO:3所示氨基酸序列的基因序列。


5.如权利要求1所述融合酶,其特征在于,所述柔性肽链为一种连接肽,所述连接肽选自(GGGGS)2、(EAAAK)3、Thermobifidafusca基因组中内切-β-木聚糖酶中连接催化结构域、CBM2结构域的天然linker序列中的一种或任意几种。


6.如权利要求5所述融合酶,其特征在于,所述连接肽选自Thermobifidafusca基...

【专利技术属性】
技术研发人员:公维丽马耀宏王丙莲刘庆艾郑岚李秋顺韩庆晔蔡雷孟庆军杨艳
申请(专利权)人:山东省科学院生物研究所
类型:发明
国别省市:山东;37

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1