本发明专利技术公开了一种VanB基因的LAMP试剂盒及其专用引物。用于检测VanB基因的LAMP引物，是根据VanB基因的特异性保守靶序列设计的，所述LAMP引物由四条引物组成，包括外引物VanB12-F3和VanB12-B3、内引物VanB12-FIP和VanB12-BIP。利用本发明专利技术可在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地定性检出纯菌、患者粪便、血液等样品中的VanB基因，无需复杂仪器，为VanB基因的检测提供了新的技术平台。
【技术实现步骤摘要】
用于检测VanB基因的LAMP试剂盒及其专用引物
本专利技术属于生物
中基因的分子生物学检测，特别是涉及一种VanB基因的LAMP试剂盒及其专用引物与其在检测VanB基因中的应用。
技术介绍
VanB基因是耐万古霉素肠球菌(VancomycinresistantEnterococci，VRE)的耐药基因型中的一种，主要存在于粪肠球菌及屎肠球菌中。VanB表型耐药基因多位于宿主染色体上，也可存在于质粒上，可通过共轭机制，由质粒介导将耐药基因在种内或种间水平或垂直传播，从而传递给其它肠球菌属或其它细菌。20世纪50年代发现的糖肽类抗生素万古霉素被用作治疗多重耐药G+菌株感染的首选药物，曾被誉为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”。自1988年英国首次分离并报道耐万古霉素肠球菌(VRE)以来，使这一最后防线面临崩溃，给临床治疗造成极大的困难，引起了广泛的重视，目前它已逐渐成为医院感染的重要病原菌之一。据报道由VRE引起的院内尿路感染所占比例为16％，仅次于大肠杆菌。VRE被美国疾病预防控制中心列为第二大医院感染病原体，在ICU院内感染患者中VRE的分离率也呈上升趋势。据我国医院感染监控网的统计分析VRE引起的院内感染在G+中排在第4位。VRE不但对万古霉素高度耐药，而且其耐药因子能转移给其它G+菌株，如致病性很强的金黄色葡萄球菌。因此，对人类构成严重威胁的不仅是VRE本身，还包括由于其耐药因子的转移可能产生的一些难以治疗的新耐药菌株。肠球菌通常为条件致病菌。当发生异位寄生时，肠球菌可引起多种感染，如泌尿系感染、心内膜炎、脑膜炎、败血症、伤口感染、呼吸道感染等，严重的可危及生命。与其它革兰氏阳性菌相比，肠球菌属具有更强的天然耐药性，且易被抗生素诱导产生新的耐药性。近年来，由于免疫抑制剂在临床治疗中广泛应用，以及广谱抗生素的过度使用及不合理应用等因素导致肠球菌属感染和耐药性日益增多，已成为院内感染的主要致病菌。随着耐万古霉素肠球菌(VRE)的出现，临床治疗耐药菌感染面临着更大的困难。根据VRE的耐药表型及能否发生耐药因子转移等特点，VRE基因型被分为VanA、VanB、VanC、VanD、VanE和VanG等6种，其中只有VanA和VanB型有重要的临床意义。VanA和VanB型VRE可呈现高水平万古霉素耐药，且其耐药因子容易发生转移，是引起感染和流行的主要病原体类型。VanB基因检测可用于判断样品是否对万古霉素耐药，以指导用药。LAMP技术介绍：环介导恒温核酸扩增技术(1oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是由Notomi(NotomiT,etal.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsRes2000；28(12):63.)专利技术的一种新型基因扩增技术。具体方法是针对靶基因(DNA或者cDNA)的6个区域，设计4-6种特异引物，利用链置换DNA聚合酶，在等温条件下进行基因扩增反应，结果直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断。具有快速高效、特异性强、灵敏度高、操作简单、检测直观和设备要求低等特点。自2000年专利技术以来，LAMP技术已被迅速用于病原微生物检测、遗传病诊断、食品安全等领域的分子生物检测领域。2011年NakauchiM等建立的基于LAMP技术的H1N1实验室快速诊断方法(NakauchiM，etal.Evaluationofreversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationassaysforrapiddiagnosisofpandemicinfluenzaA/H1N12009virus.JMedVirol.2011Jan；83(1):10-5.)目前，LAMP已被广泛用于肺炎支原体(GotohK,etal.Assessmentoftheloop-mediatedisothermalamplificationassayforrapiddiagnosisofMycoplasmapneumoniaeinpediatriccommunity-acquiredpneumonia.JpnJInfectDis.2013；66(6):539-42.)、结核杆菌(KumarP,etal.Loop-mediatedisothermalamplificationassayforrapidandsensitivediagnosisoftuberculosis.PandyaD,SinghN,JInfect.2014Sep9.[Epubaheadofprint])、SARS(PoonLL,etal.Rapiddetectionofthesevereacuterespiratorysyndrome(SARS)coronavirusbyaloop-mediatedisothermalamplificationassay.ClinChem.2004Jun；50(6):1050-2.)、HIV(CurtisKA,etal.Real-TimeDetectionofHIV-2byReverseTranscription-Loop-MediatedIsothermalAmplification.JClinMicrobiol.2014Jul；52(7):2674-6.)等疾病的检测中等病原体的诊断。近期爆发于西非的埃博拉病毒的LAMP检测试剂盒已研究成功。目前，国内未见有用于检测VanB基因的LAMP试剂盒及其专用引物。
技术实现思路
本专利技术提供了用于对VanB基因进行LAMP检测的引物，以实现VanB基因的批量检测，提高检测的特异性和灵敏度。本专利技术所提供的用于检测VanB基因的LAMP引物，是根据VanB基因P1基因(GenBank号：CP002077.1)的特异性保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、患者粪便、血液等样品中的VanB基因，所述LAMP引物由四条引物组成，包括外引物VanB12-F3和VanB12-B3、以及内引物VanB12-FIP和VanB12-BIP的组合；所述VanB基因的特异性保守靶序列如序列表中SEQIDNO：1所示。具体来讲，所述用于对VanB基因进行LAMP检测的四条引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2(VanB12-F3)、SEQIDNO：3(VanB12-B3)、SEQIDNO：4(VanB12-FIP)和SEQIDNO：5(VanB12-BIP)所示。所述的LAMP引物，为外引物VanB12-F3和VanB12-B3、内引物VanB12-FIP和VanB12-BIP按摩尔比5:40的组合物。本专利技术的第二个目的是提供一种用于对VanB基因进行LAMP检测的试剂盒。本专利技术所提供的试剂盒，包括上述用于对VanB基因进行LAMP检测的引物。具体来讲，所述试剂盒包括以下用于25μL反应体系(不含模板)的试剂：Mixture(主要成分包括：2mMTris·HCl(pH8.8)0.7μL，10mMKCl3.8μL，10mM(NH4)2SO43.8μL，0.1％Tween200.4μL，0.8M甜菜碱(betaine)0本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测VanB基因的LAMP引物，是根据VanB基因P1基因(GenBank号：CP002077.1)的特异性保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、患者粪便、血液等样品中的VanB基因，所述LAMP引物由四条引物组成，包括外引物VanB12‑F3和VanB12‑B3、以及内引物VanB12‑FIP和VanB12‑BIP的组合；所述VanB基因的特异性保守靶序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.用于检测VanB基因的LAMP引物，是根据GenBank号为CP002077.1的VanB基因P1的特异性保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、患者粪便或血液样品中的VanB基因，所述VanB基因的特异性保守靶序列如序列表中SEQIDNO：1所示，所述LAMP引物由四条引物组成，包括核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的外引物VanB12-F3和VanB12-B3、以及核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示的内引物VanB12-FIP和VanB12-BIP的组合。2.根据权利要求1所述的用于检测VanB基因的LAMP引物，其特征在于：所述的LAMP引物，为外引物VanB12-F3和VanB12-B3、内引物VanB12-FIP和VanB12-BIP按摩尔比5:40的组合物。3.一种用于对VanB基因进行LAMP检测的试剂盒，包括权利要求1或2所述用于对VanB基因进行LAMP检测的引物。4.根据权利要求3所述的用于对VanB基因进行LAM...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁静，李环，赵向娜，王雪松，魏晓，林维石，
申请(专利权)人：中国人民解放军疾病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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