在cfDNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因修饰差异的引物对组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种在cfDNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因修饰差异的引物对组及试剂盒。本发明专利技术首先公开了一组在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的引物对组，该引物对组由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.15所示的核苷酸序列组成。本发明专利技术进一步公开了包含上述引物组的试剂盒。本发明专利技术在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的引物对组及试剂盒，该检测具有高敏感性和特异性，对肿瘤风险预测以及疗效评估具有重要的价值。

【技术实现步骤摘要】
在cfDNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因修饰差异的引物对组及试剂盒
本专利技术涉及生物
更具体地，涉及一种在cfDNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因修饰差异的引物对组及试剂盒。
技术介绍
1、液体活检：在肿瘤预防与治疗的临床需求中，液体活检已成为肿瘤风险预测、靶向药物用药指导以及疗效评估的重要手段，其中肿瘤的早期风险评估是肿瘤预防的最重要的环节。血液因其含有大量肿瘤相关信息无疑是液体检测的最佳样本，其中外周血游离DNA是目前液体活检关注的热点，该游离DNA存在于血浆或血清中，它既可能来自于正常细胞死亡的释放物，也可能来自于肿瘤或癌前病变细胞的死亡释放物，同时无论正常细胞还是肿瘤细胞均可主动释放。2、结构性改变的检测：由于肿瘤细胞均涉及不同程度的基因突变，当前针对结构性改变的检测成为关注的热点，该靶标的检测在肿瘤实体组织相对容易，这是因为实体肿瘤组织中，含有突变的靶基因丰度较高，但在外周血中则较为困难，这是因为来自于肿瘤细胞的DNA(ctDNA)在外周血中的浓度很低，同时在靶基因中一些位点的突变频率也很低，另外需要强调的是，结构性改变发生的位点与频率在很多肿瘤中差异很大，并具有随机性，并且这些结构性改变在疾病的进程中还是一个不断积累的过程，所以这些因素的叠加将导致检测的敏感度显著下降。特别是在肿瘤的早期，来自于结构性改变的DNA在肿瘤外周血中的丰度更低，从而给检测带来了极大的挑战。尽管目前二代测序可以通过增加测序的深度来增加其敏感性，但一方面成本显著的增高。同时另一方面并不是基因所有结构性改变都与肿瘤有关，即有些突变并没有发现其与肿瘤的相关性。3、表观遗传学修饰的检测：肿瘤的发生发展过程中，虽然关键基因的结构改变在其过程中起着非常重要的作用，但更多的还是表现在关键基因表观遗传学修饰的变化。相对于基因结构改变的低丰度，基因的修饰变化则更为普遍，这样针对靶基因修饰的检测则具有更高的敏感性。表观遗传学研究发现，基因的修饰与其表达能力密切相关，这些修饰主要表现在DNA的甲基化和组蛋白的各种修饰上。近来研究发现，表观遗传学修饰位点既可发生在基因的启动子序列，也可发生在基因体(GeneBody，包含外显子、内含子以及两端的非翻译区)中。已知基因启动子的甲基化程度与基因表达呈负相关(影响转录因子以及RNA聚合酶的结合)，但对基因体中表观遗传学修饰的功能仍不清楚，当前的研究主要集中在对基因启动子区域的表观遗传学修饰上，而对基因体中各种表观遗传学修饰的变化则关注很少。4、靶基因的选择：肿瘤相关的靶基因鉴定长期以来都是肿瘤分子检测的热点，基于肿瘤发生发展某个时间点的样本鉴定出的靶基因，仅代表肿瘤基因图谱中的一个截面，其中还包括有些是一过性的改变，不能反映出其在肿瘤发生、发展过程中的地位以及动态变化。这样找到在肿瘤发生、发展过程中持续作用的靶基因，并鉴定出其在此过程中的作用，是肿瘤风险防控以及疗效评价的迫切需要。追溯造成基因突变的原因，发现基因组中的碱基突变并不是随机的，C>T的突变占很高的比例，进一步研究发现该突变是由胞嘧啶脱氨导致的，而该脱氨过程是在胞嘧啶脱氨酶作用下完成的。研究发现，胞嘧啶脱氨酶作为细胞应激反应的重要调控基因，其在几乎所有的肿瘤细胞中均为高表达，是造成细胞基因突变的原因，其持续性的高表达也是造成肿瘤细胞突变积累以及肿瘤异质性的主要因素。目前发现导致胞嘧啶脱氨的酶包括：APOBEC3s家族(ApolipoproteinBmRNA-editingcatalyticpolypeptide)，AID(Activation-inducedCytidineDeaminase)，其作用是造成单链DNA中的胞嘧啶脱氨基，形成尿嘧啶(U)，单链DNA的状态在此过程中具有重要的作用，而YB1作为单链DNA结合蛋白被报道在肿瘤中广泛性高表达。另外细胞负反馈调控机制显示，突变还可引起细胞切除修复蛋白的上调，如MLH1被报道在肿瘤中广泛性高表达。所以在胞嘧啶脱氨酶致DNA突变的过程中，其相关分子功不可没，最终在这些分子的相互配合下导致细胞出现基因的突变、缺失、融合以及染色体转位等多种异常。因此，胞嘧啶脱氨酶及其相关分子在肿瘤发生发展过程中具有重要的作用，对其进行检测具有重要的临床意义
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一组特异性强、灵敏度高的在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的引物对组，其对肿瘤的风险评估、疗效评价以及预后预测，具有重要的临床指导意义。本专利技术的另一个目的在于提供一种操作简单、结果准确的在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的试剂盒。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：专利技术人研究发现，在高的变性温度(94℃)下，表观遗传学修饰对DNA的解链没有明显的影响，表现为完全解链,定量PCR扩增的Ct值标记为CtHT；但在低温变性条件(实验条件需要摸索)下，表观遗传学修饰则对DNA的解链有较大的影响，表现为解链程度的不同，进而影响PCR扩增的效率，定量PCR扩增的Ct值标记为CtLT，△Ct＝|CtHT–CtLT|。在定量PCR扩增过程中，专利技术人发现来自于正常人和肿瘤患者靶基因某些区域的DNA片段，在低温变性条件下，对其扩增效率的影响显著不同，这样通过选择低温变性条件可鉴定出正常来源以及肿瘤来源的靶基因。专利技术人研究发现在低温变性条件下，相对于正常人，肿瘤患者外周血游离DNA中靶基因某些区域片段更难以解链，表现为扩增效率的降低，△Ct值增大；为进一步证明这种差异来自于表观遗传学修饰的不同，专利技术人以稀释后的PCR产物为模板进行再次扩增(该PCR产物为没有任何修饰的裸露DNA)，发现其ΔCt值尽管与少部分正常人来源的DNA样本比较接近，但与大部分正常人和几乎所有肿瘤患者来源的DNA样本显著的不同。以上结果表明：正常人来源与肿瘤来源的外周血游离DNA存在不同程度的表观遗传学修饰，这种修饰在DNA的提取过程中仍然得以保留，这样可根据正常人与肿瘤患者ΔCt值的不同，鉴定正常人与肿瘤患者胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰的不同。进一步研究发现，在正常人与肿瘤患者外周血来源的游离DNA中，单个区域修饰差异的变化范围较大，为此进一步对靶基因的不同区域进行了综合分析，采用SPSS软件对不同区域的ΔCt值进行加权计算，不同区域xn的ΔCt标记为△Ctxn，通过赋予不同区域△Ctxn不同的系数，得到△Ct加权值。专利技术人通过大量的筛选实验，获得了用于检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同区域片段表观遗传学修饰差异的引物对组，并得到了对应的△Ct，进一步对这些不同区域片段△Ct值的加权分析，得到了用以鉴别肿瘤与正常人来源的△Ct加权值以及检测阈值(CutOff值)，并据此对样本进行放大检测，并进行敏感性与特异性分析。基于以上研究，本专利技术首先提供了一组在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的引物对组，该引物对组由序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.15所示的核苷酸序列组成；其中，序列SEQIDNo.1和SEQIDNo.2分别为扩增AID基因启动子区域片段长度为145bp的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo.3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的引物对组，其特征在于，该引物对组由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.15所示的核苷酸序列组成；其中，序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增AID基因启动子区域片段长度为145bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.3为扩增该区域片段的探针；SEQ ID No.4和SEQ ID No.5分别为扩增AID基因外显子3区域片段长度为169bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.6为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.7和SEQ ID No.8分别为扩增APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.10和SEQ ID No.11分别为扩增YB1基因启动子区域片段长度为102bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.12为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.13和SEQ ID No.14分别为扩增MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.15为扩增该区域片段的探针。...

【技术特征摘要】
1.一组在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的引物对组，其特征在于，该引物对组由序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.15所示的核苷酸序列组成；其中，序列SEQIDNo.1和SEQIDNo.2分别为扩增AID基因启动子区域片段长度为145bp的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo.3为扩增该区域片段的探针；SEQIDNo.4和SEQIDNo.5分别为扩增AID基因外显子3区域片段长度为169bp的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo.6为扩增该区域片段的探针；序列SEQIDNo.7和SEQIDNo.8分别为扩增APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo.9为扩增该区域片段的探针；序列SEQIDNo.10和SEQIDNo.11分别为扩增YB1基因启动子区域片段长度为102bp的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo.12为扩增该区域片段的探针；序列SEQIDNo.13和SEQIDNo.14分别为扩增MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp的上游引物和下游引物，序列SEQIDNo.15为扩增该区域片段的探针。2.一种在外周血游离DNA中检测检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物对组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括质控对照DNA样品，其中，所述质控对照DNA样品包括AID基因启动子区域片段长度为145bp裸露DNA、AID基因外显子3区域片段长度为169bp裸露DNA、APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp裸露DNA、YB1基因启动子区域片段102bp裸露DNA和MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp裸露DNA。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液和ddH2O。5.一种如权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：抽提外周血游离DNA；使用由序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.15所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱运峰，石焕焕，李健雄，
申请(专利权)人：朱运峰，
类型：发明
国别省市：北京,11